Hierin beschrijven we een chirurgische ingreep die laat zien hoe u permanente ligatie van de linker-anterieure aflopende coronaire slagader bij muizen bereikt. Dit model is van groot belang om de pathofysiologie van myocardiaal infarct en de gelijktijdige biologische processen te onderzoeken.
Myocardinfarct (MI) en acute coronaire ziekten behoren tot de meest prominente doodsoorzaken in de populatie met westerse levensstijl. De Murine modellen van Mi met permanente ligatie van linker-anterior aflopend (LAD) coronaire hartslag nauw bootst mi bij de mens. Murine modellen profiteren van de uitgebreide genetische techniek die tegenwoordig beschikbaar is. Hier stellen we een reproduceerbare Murine chirurgische model van myocardinfarct door permanente LAD coronaire ligatie. Onze techniek omvat anesthesie met ketamine/xylazine die snel kan worden teruggedraaid door toediening van een antagonist, intubatie zonder tracheotomie voor mechanisch geassisteerde ventilatie, ventilatie met toepassing van Extrinsieke positieve end-expiratory Pressure (PEEP) om te voorkomen dat alveolaire instorting, een Thoracotomie methode die beperkt is tot de minimale chirurgische letsels aan skeletspieren, en Long inflatie zonder thoracentese. Deze methode is dun invasief, reproduceerbaar en vermindert de sterfte en complicaties na de operatie.
Acuut myocardinfarct (MI) is de ernstigste expressie van ischemische hartziekten (IHD). IHD zijn de belangrijkste oorzaak van de morbiiteiten en de dood wereldwijd, vooral in westerse landen1. Het heeft dus een enorme economische impact op gezondheidszorgstelsels2. MI wordt gekenmerkt door de occlusie van een coronaire slagader door atherosclerotische plaque en de daaropvolgende arrestatie van de bloedstroom in grote delen van het myocardium. Gebrek aan zuurstoftoevoer in het myocardium leidt tot ischemische dood van cardiomyocyten. Deze pathologische aandoening activeert reacties in het ventriculaire weefsel dat uiteindelijk leidt tot tekortkomingen in ventriculaire functies, remodellering en hartfalen3. MI is een complexe pathofysiologische aandoening waarbij meerdere en ingewikkelde biologische processen bestaande uit gereguleerde celdood, reactie op oxidatieve stress, ontsteking, wondgenezing, fibrose en ventriculaire remodellering. Sommige van deze biologische reacties zijn gemodelleerd als individuele processen in vitro zoals necrose-geïnduceerde vrijlating van schade-geassocieerde moleculaire patronen en geassocieerde inflammatoire reacties4. Deze vereenvoudigde modellen zijn essentieel om MI te begrijpen. Maar alleen een in vivo model kan een realistisch beeld geven van de complexiteit van de biologische processen die zijn betrokken bij de respons op MI.
Hoewel modellen van MI bij grotere dieren zoals varkens meer in verband kunnen staan met menselijke pathofysiologie van MI, ligt de kracht van de Murine-modellen in de mogelijkheden die worden geboden door genetische manipulatie die geavanceerder is dan bij andere zoogdieren. Andere niet-verwaarloosbare aspecten zijn de relatief lage kosten en de eenvoud van de chirurgische Setup.
Het is de moeite waard om te vermelden dat modellen van ischemie-reperfusie van het myocardium verschillende uitkomsten kunnen vertonen dan permanente MI-modellen. Biologische processen zoals het type celdood betrokken, kwaliteit/amplitude of kinetiek van inflammatoire en wondgenezing reacties in het myocard weefsel kan variëren afhankelijk van het model5,6,7. Dit Protocol van permanente coronaire occlusie kan echter gemakkelijk worden aangepast om een ischemie-reperfusie model te verkrijgen.
Deze methode is relevant voor studies die verband houden met de fysioathologie van MI zonder reperfusie en maakt het mogelijk om pathologische processen te monitoren die optreden bij coronaire occlusie (minuten) tot laat stadium hartfalen (weken) bij het lokale hartweefsel en systemische Niveaus.
De eerste kritieke stap van deze procedure is zeker intubatie. We gebruiken de gebloteerde binnennaald van een 16 G katheter als tracheale buis. We raden u af deze Setup te gebruiken met muizen die minder dan 22 g gewicht hebben. Met deze instelling kan het moeilijk zijn om muizen correct te intuberen met een kleiner lichaamsgewicht zonder de luchtpijp te beschadigen. Een ander belangrijk punt is het beperken van incisies gemaakt aan de spier terwijl blootstelling van de luchtpijp en ribcage. Vermindering van weefselschade is van groot belang, vooral bij het bestuderen van ontstekingsprocessen na MI. Daarom geven we de voorkeur aan een zachte spreiding van spieren en ribben met Tang en oprol kers8,9. We gebruiken geen elektrische verschroeide om bloeden10te controleren. Dit kan leiden tot iatrogene brandwonden en gunst infecties. Zowel trauma als infecties kunnen vooroordelen inflammatoire Read-outs. Toepassing van een extrinsieke PEEP van 3 cm H2O door het plunderen van de ventilatie uitlaat in een waterbuis grenzen einde-expiratory alveolaire instorting tijdens Thoracotomie. Lokalisatie van LAD is een andere kritieke stap en men moet in gedachten houden dat de anatomie van de coronaire slagaders kan variëren afhankelijk van de stam en het genotype van de muis11. Het vereist enige ervaring om de jongen te visualiseren, maar het plaatsen van de hechtdraad direct 2-3 mm onder de linker atria zoals beschreven in de procedure moet de juiste positionering van de ligatie mogelijk maken. Onmiddellijke verkleuring van grote delen van de linker ventrikel onder de hecht bevestigen de nauwkeurigheid. Ten slotte, kunstmatig toepassen van auto-PEEP door het blokkeren van ventilatie uitlaat voor 2-3 respiratoire cycli tijdens borstsluiting maakt een voorbijgaande hyperinflatie van de longen die zal helpen achtervolgen de lucht van thoracale holte12. We hebben opzettelijk geen thoracentese uitgevoerd zoals getoond in 9,10. Op deze manier beperken we het risico op Long-en hart blessures en vermijden we overmatige weefselbeschadiging of perforatie.
Myocardiale ischemie-reperfusie (I/R) is een verwant chirurgisch model dat het herstel van de coronaire bloedstroom nabootst dat wordt gedaan om MI-patiënten in klinieken. Tijdens het I/R-model wordt een voorbijgaande occlusie van de coronaire slagader gedaan door een stukje slang op de jongen te spannen voor een duur van 20 tot 45 min8,13. Vervolgens wordt de occlusie vrijgegeven om reperfusie van het myocardium voor de gewenste duur mogelijk te maken. Deze eenvoudige wijziging toegepast op ons protocol kan gemakkelijk veranderen in een I/R model4,8,14,15. Het infarct kan worden bevestigd door een bloedtest voor cardiale troponine T8,10 of door echocardiografie15.
MI verschilt van I/R-model omdat reperfusie door zelf een blessure induceert. MI induceert meer weefsel necrose en apoptosis is meer uitgesproken in reperfused myocardium5. Kinetiek van inflammatoire cellen infiltratie is ook verschillend tussen in MI en IR met een vertraagde myocardiale infiltratie van immuuncellen in MI7. De grootte en de positie van het hart gebied zullen ook verschillen tussen permanente ligatie en I/R-modellen15. Om dit in gedachten te houden, moet men voorzichtig zijn om een relevant model te kiezen sinds I/R en permanente MI-modellen niet gelijkwaardig zijn. Een ander Murine model van myocardinfarct is het cryoinfarct model. Toepassing van een cryogene sonde op de LV anterieure muur induceert de bevriezing van ventriculaire weefsel en bloedstroom arrestatie in de LAD slagader. Deze techniek verschilt echter van Mi-en I/R-technieken met betrekking tot timing en amplitude van remodellering en ontstekingsreacties16,17.
Variabiliteit is een beperking als voor elke chirurgische ingreep. Deze variabiliteit berust op biologische verschillen. Een goed voorbeeld is de variatie in coronaire arteriële indeling in muizen11. Het vertrouwt ook op experiteerder vaardigheden. Het is de moeite waard te vermelden dat een adequate opleiding van de onderzoekers verplicht is om met dit model tot stabiele resultaten te komen. Een goed opgeleide experimenteerder kan gemakkelijk infarct maten produceren die reproduceerbaar zijn (Figuur 3a-B). De sterfte van het model hangt af van de positie van de jongen, duur van de experimenten (dagen, weken), muis stam en genotypes. De soorten anestheticum en analgetische drugs kunnen ook invloed hebben op de uitkomst van de experimenten met vermoedelijke cardioprotective of cardiodepressivum effecten. In onze handen heeft dit model een wereldwijd sterftecijfer van 25-30%. Dit sterftecijfer bestaat uit spontane sterfgevallen en offers voor het einde van het experiment, ongeacht de stammen en de duur van het experiment. De meeste doden of opofferingen liggen tussen de tweede en vierde dagen na de operatie. Het toepassen van een streng pijnmanagement en follow-up van de dieren kan de sterfte verminderen.
Hier presenteren we representatieve resultaten van infarct grootte geanalyseerd met behulp van TTC-kleuring en expressie van eiwitten en genen die betrokken zijn bij inflammatoire of fibrotische processen in LV door respectievelijk Western Blot en real-time PCR (figuur 3c-G). Het is ook mogelijk om veel van deze parameters te meten door middel van enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) of enzymatische assays. Natuurlijk, in overeenstemming met de hypothese die moet worden getest, deze methode kan worden gevolgd door elke functionele analyse door echografie, MRI of intraveneuze triculaire katheter meting van de druk en het volume. Het is ook mogelijk om hart te extraheren en verder te onderzoeken cardiale celbiologie op geïsoleerde cellen. Over het algemeen is het MI-model met permanente ligatie van de LAD-coronaire slagader vooral nuttig om inflammatoire en fibrotische processen te evalueren, wondgenezing en veranderingen in de hartfunctie na een myocardinfarct.
The authors have nothing to disclose.
Dit model werd ontwikkeld met de steun van de Swiss National Science Foundation (subsidies 310030_162629 tot LL) en departementale fondsen van de diensten van thoracale chirurgie en Intensive Care Geneeskunde van het universitair ziekenhuis van Lausanne. JL is ontvanger van een subsidie van de Emma Muschamp Foundation. Wij erkennen de cruciale steun van de dierenartsen en het personeel van de dieren faciliteit van de faculteit biologie en geneeskunde van de Universiteit van Lausanne. We danken Dr. Giuseppina Milano van de dienst van cardiale chirurgie van het universitair ziekenhuis van Lausanne en Dr. Alexandre Sarre van de cardiovasculaire Assessment Facilty van de Universiteit van Lausanne voor hun technische tips.
1 CC Syringe, Omnifix-F | B. Braun | 9161406V | |
30G- Needle | BD Microlance 3 | 304000 | |
70% Ethanol | |||
Betadine 60 ml | MundiPharma | ||
Blunt Retractors | Fine Science Tools | 18200-09 | |
Castroviejo Needle Holder Straight with Lock | Roboz | RS-6416 | |
Cotton Swabs | Applimed SA | 6001109 | |
Dissecting Scissors, Curved | Aesculap | BC603R | |
Electrical Razor | Remington | HC720 | |
Glucose 5% B.Braun | B. Braun | 531032 | |
Hair Removal Cream, Veet | Silk & Fresh Tech. | 8218535 | |
Iris Dissecting Forceps Full Curved | Aesculap | OC022R | |
Ketasol 100 (100 mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN01AX03 | |
Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt | Aesculap | FM013R | |
NaCl 0.9% B. Braun | B. Braun | 534534 | |
Short Fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
Silk Suture 5-0, BB | Ethicon | K880H | |
Silk Suture 6-0, P-1 | Ethicon | 639H | |
Silk Suture 7-0,BV-1 | Ethicon | K804 | |
Student Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
Student Fine Forceps-Angled | Fine Science Tools | 91110-10 | |
Surgical Gloves | Weitacare | 834301 | |
Surgical heating pad | Personalized setting | ||
Temgesic sol 0.3 mg/ml Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | N02AE01 | |
Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat | Abbocath-T | G714-A01 | |
Universal S3 Microscope, OMPIMD | Zeizz | ||
Ventilator, MiniVent Model 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Viscotears | Alcon | 1551535 | |
Xylasol (1mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN05CM92 |