تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9
Summary
نحن نصف طريقة لاستخدام قياس التدفق متعدد المعلمات للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعليالميتوكوندريا (ROS) في الجذعية المكونة للدم الصحية والخلايا السلف الصحية (HSPCs) وخلايا سرطان الدم من نموذج الماوس من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) مدفوعا MLL-AF9.
Abstract
نقدم نهج قياس التدفق لتحليل الميتوكوندريا ROS في مختلف النخاع العظمي الحي (BM) المستمدة من الجذعية وخلايا السلف من الفئران السليمة وكذلك الفئران مع مكافحة غسل الأموال التي يقودها MLL-AF9. على وجه التحديد، ونحن نصف عملية تلطيخ الخلايا من خطوتين، حيث يتم تلوين الخلايا BM صحية أو سرطان الدم أولا مع صبغة فلورية التي تكشف عن الأكاسيد الفائقة الميتوكوندريا، تليها تلطيخ مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المرتبطة بالفلوروكروم التي تستخدم للتمييز بين مختلف السكان السلف المكونة للدم صحية وخبيثة. كما نقدم استراتيجية للحصول على العينات وتحليلها عن طريق قياس التدفق. ويمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في إطار زمني قصير يصل إلى 3-4 ح. كما نسلط الضوء على المتغيرات الرئيسية التي يجب أخذها في الاعتبار وكذلك مزايا وقيود مراقبة إنتاج ROS في المقصورة الميتوكوندريا للخلايا الحية وجذع ابيضاض الدم والخلايا الفرعية السلف باستخدام الأصباغ الفلورية عن طريق قياس التدفق . وعلاوة على ذلك، نقدم بيانات أن وفرة ROS الميتوكوندريا تختلف بين السكان الفرعيين HSPC صحية متميزة وذرية سرطان الدم ومناقشة التطبيقات المحتملة لهذه التقنية في بحوث الدم.
Introduction
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات تفاعلية عالية مشتقة من الأكسجين الجزيئي. الموقع الخلوي الأكثر تحديدا من إنتاج ROS هو الميتوكوندريا، حيث يتم امتصاص الإلكترونات التي تمر عبر سلسلة نقل الإلكترون (ETC) أثناء الفسفورية التأكسدية (OXPHOS) عن طريق الأكسجين الجزيئي مما يؤدي إلى تشكيل محددة نوع من ROS يسمى الأكاسيد الفائقة1. من خلال إجراءات سلسلة من الإنزيمات، تسمى ديسموتاسيس فوق أكسيد أو SODs، يتم تحويل الأكاسيد الفوقية إلى بيروكسيد الهيدروجين، والتي يتم تحييدها في وقت لاحق في الماء بواسطة إنزيمات مثل الكاتالاز أو الجلوتاثيون بيروكسيداسيس (GPX). يمكن أن تؤدي الاضطرابات في آليات تنظيم ROS إلى الإنتاج الزائد من ROS، والتي غالباً ما يشار إليها باسم الإجهاد التأكسدي، والتي لها عواقب خلوية ضارة وقاتلة مثل تلف جزيء الماكرو (أي الحمض النووي والبروتين والدهون). وعلاوة على ذلك، يرتبط الإجهاد التأكسدي إلى العديد من الأمراض، مثل مرض السكري والأمراض الالتهابية والشيخوخة والأورام2،3،4. للحفاظ على التوازن الأكسدة ومنع الإجهاد التأكسدي، والخلايا تمتلك مجموعة متنوعة من آليات تنظيم ROS5.
المستويات الفسيولوجية لبعض ROS ضرورية للسلّم الأوّل والبالغين 6. ومع ذلك، يرتبط ROS الزائدة مع تلف الحمض النووي، والتمايز الخلوي واستنفاد الجذعية المكونة للدم وتجمع السلف. وهناك أيضا أدلة على أن التعديلات في علم الأحياء الأكسدة قد تختلف بين سرطان الدم والخلايا السليمة. على سبيل المثال، مستويات ROS تميل إلى أن تكون أعلى في خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) نسبة إلى نظرائهم الأصحاء ودراسات أخرى قد اقترحت أن الخلايا الجذعية سرطان الدم الحفاظ على مستوى ثابت منخفض من ROS للبقاء على قيد الحياة7،8. الأهم من ذلك، وقد أظهرت استراتيجيات للاستفادة العلاجية على هذه الاختلافات الأكسدة الوعد في العديد من إعدادات السرطان البشري9،10. لذلك، فإن الاختبارات التي تسمح بتقييم مستويات ROS في نماذج الماوس قد تحسن فهمنا لكيفية مساهمة هذه الأنواع في علم وظائف الأعضاء الخلوية ومسببات الأمراض، فضلا عن إمكانية توفير منصة لتقييم فعالية العلاجات الجديدة التي تستهدف السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأصباغ الفلورية التي تم تطويرها للكشف عن ROS يتم تقييمها في كثير من الأحيان في الخلايا الثابتة عن طريق الفحص المجهري أو في الخلايا الحية عن طريق قياس التدفق22. تدفق التقييم الخلوي من ROS الميتوكوندريا في خلايا BM باستخدام الميتوكوندريا ROS الأصباغ الفلورية له ميزتان رئيسيتان: 1) وه…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس إدارة مركز فوكس تشيس للسرطان (DDM)، وجائزة الجمعية الأمريكية لأمراض الدم (SMS)، الجمعية الأمريكية للسرطان RSG (SMS) ووزارة الدفاع (Award#: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Riferimenti
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
