Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9
Summary
Nous décrivons une méthode pour utiliser la cytométrie multiparale de flux pour détecter les espèces réactives d’oxygène mitochondriales (ROS) dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices saines murines (HSPc) et les cellules de leucémie d’un modèle de souris de leucémie myéloïde aigue (AML) conduit par MLL-AF9.
Abstract
Nous présentons une approche cytométrique de flux pour analyser le ROS mitochondrial dans diverses populations vivantes de cellules souches et progénitrices dérivées de la moelle osseuse (BM) provenant de souris en bonne santé ainsi que de souris atteintes de LAM entraînées par MLL-AF9. Plus précisément, nous décrivons un processus de coloration cellulaire en deux étapes, par lequel les cellules saines ou la leucémie BM sont d’abord tachées d’un colorant fluorogénique qui détecte les superoxydes mitochondriaux, suivie de coloration avec des anticorps monoclonaux fluorochrome-liés qui sont utilisés pour distinguer diverses populations hématopoïétiques saines et malignes. Nous fournissons également une stratégie pour l’acquisition et l’analyse des échantillons par cytométrie de flux. L’ensemble du protocole peut être réalisé dans un délai aussi court que 3-4 h. Nous soulignons également les variables clés à considérer ainsi que les avantages et les limites de la surveillance de la production de ROS dans le compartiment mitochondrial des sous-populations vivantes de tige sémino-tige et de leucémie et progénitrice utilisant des colorants fluorogènes par cytométrie de flux . En outre, nous présentons des données que l’abondance mitochondriale de ROS varie parmi les sous-populations saines distinctes de HSPC et les progéniteurs de leucémie et discutons des applications possibles de cette technique dans la recherche hématique.
Introduction
Les espèces réactives d’oxygène (ROS) sont des molécules fortement réactives dérivées de l’oxygène moléculaire. L’emplacement cellulaire le plus bien défini de la production de ROS est les mitochondries, où les électrons qui passent par la chaîne de transport d’électrons (ETC) pendant la phosphorylation oxydative (OXPHOS) sont absorbés par l’oxygène moléculaire menant à la formation d’un spécifique type de ROS appelé superoxydes1. Grâce aux actions d’une série d’enzymes, appelées dismutases de superoxyde ou SODs, les superoxydes sont convertis en peroxydes d’hydrogène, qui sont ensuite neutralisés en eau par des enzymes telles que la catalase ou les peroxidases de glutathion (GPX). Les perturbations dans les mécanismes de régulation ROS peuvent conduire à la production excédentaire de ROS, souvent appelé stress oxydatif, qui ont des conséquences cellulaires nocives et potentiellement mortelles telles que les dommages aux macromolécules (c.-à-d. ADN, protéines, lipides). En outre, le stress oxydatif est lié à plusieurs pathologies, telles que le diabète, les maladies inflammatoires, le vieillissement et les tumeurs2,3,4. Pour maintenir l’homéostasie redox et prévenir le stress oxydatif, les cellules possèdent une variété de mécanismes ros-régulateur5.
Les niveaux physiologiques de certains ROS sont nécessaires pour l’hématopoiesis embryonnaire et adulteapproprié 6. Cependant, l’excès de ROS est associé aux dommages d’ADN, à la différenciation cellulaire et à l’épuisement de la tige hématopoïétique et de la piscine d’ancêtre. Il existe également des preuves que les altérations de la biologie du redox peuvent différer entre la leucémie et les cellules saines. Par exemple, les niveaux de ROS ont tendance à être plus élevés dans les cellules de leucémie myéloïde aigue (LAM) par rapport à leurs homologues en bonne santé et d’autres études ont suggéré que les cellules souches de leucémie maintiennent un faible niveau stable de ROS pour la survie7,8. Fait important, les stratégies de capitalisation thérapeutique sur ces différences redox se sont avérées prometteuses dans plusieurs contextes de cancer humain9,10. Par conséquent, les essais qui permettent l’évaluation des niveaux de ROS dans les modèles de souris peuvent améliorer notre compréhension de la façon dont ces espèces contribuent à la physiologie cellulaire et la pathogénie de la maladie ainsi que potentiellement fournir une plate-forme pour évaluer l’efficacité de de nouvelles thérapies anticancéreuses ciblant le redox.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les colorants fluorogéniques qui ont été développés pour la détection de ROS sont fréquemment évalués dans les cellules fixes par microscopie ou dans les cellules vivantes par cytométrie de flux22. L’évaluation cytométrique de flux du ROS mitochondrial dans les cellules de BM utilisant les colorants fluorogenic mitochondriaux de ROS a deux avantages principaux : 1) C’est une technique rapide et simple qui convient à l’analyse de cellules vivantes et 2) elle permet de distinguer et d’a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), l’American Society of Hematology Scholar Award (SMS), l’American Cancer Society RSG (SMS) et le Department of Defense (Award: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Riferimenti
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