뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석
Summary
우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.
Abstract
우리는 MLL-AF9에 의해 구동되는 AML을 가진 마우스뿐만 아니라 건강한 마우스에서 다양한 살아있는 골수 (BM) 파생된 줄기 및 전구 세포 인구에 있는 미토콘드리아 ROS를 분석하기 위한 교류 세포 측정 접근을 제시합니다. 구체적으로, 우리는 건강한 또는 백혈병 BM 세포가 미토콘드리아 과산화물을 검출하는 형광성 염료로 먼저 염색되고, 그 다음에 사용되는 불소크롬 연결된 단클론 항체로 염색하는 2 단계 세포 염색 과정을 기술합니다. 다양한 건강하고 악성 조혈 선조 집단을 구별합니다. 우리는 또한 유세포분석에 의한 시료를 획득하고 분석하기 위한 전략을 제공합니다. 전체 프로토콜은 3-4 시간만큼 짧은 시간 내에 수행 될 수있다. 우리는 또한 살아있는 조혈 및 백혈병 줄기 및 전구 소집단의 미토콘드리아 구획에서 ROS 생산을 모니터링하는 장점과 한계뿐만 아니라 유세포 측정에 의한 형광 염료를 사용하여 고려해야 할 주요 변수를 강조합니다. . 게다가, 우리는 미토콘드리아 ROS 풍부가 명백한 건강한 HSPC 하위 인구 및 백혈병 전구체 사이에서 변화한다는 것을 데이터를 제출하고 혈액학 연구에서 이 기술의 가능한 응용을 토론합니다.
Introduction
반응성 산소 종 (ROS)은 분자 산소에서 파생 된 반응성이 높은 분자입니다. ROS 생산의 가장 잘 정의 된 세포 위치는 미토 콘 드리 아, 어디 전자 수송 사슬을 통해 통과 하는 전자 (ETC) 산화 인 산화 동안 (OXPHOS) 특정의 형성으로 이어지는 분자 산소에 의해 흡수 수퍼 옥사이드1이라고불리는 ROS의 유형 . 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 또는 SOD라고 하는 일련의 효소의 활동을 통해, 수퍼옥사이드는 과산화수소로 변환되며, 이 수소는 카탈라제 또는 글루타티온 과산화효소(GPX)와 같은 효소에 의해 물로 중화됩니다. ROS 조절 메커니즘의 교란은 종종 산화 스트레스라고도 하는 ROS의 과잉 생산으로 이어질 수 있으며, 이는 거대 분자 손상 (즉, DNA, 단백질, 지질)과 같은 유해하고 잠재적으로 치명적인 세포 결과를 가지고 있습니다. 더욱이, 산화 스트레스는 당뇨병, 염증성 질환, 노화 및 종양2,3,4와같은 여러 병리와 관련이 있다. 항상성을 유지하고 산화 스트레스를 방지하기 위해 세포는 다양한 ROS 조절 메커니즘을 가지고5.
특정 ROS의 생리수준은 적절한 배아 및 성인 조혈에 필요하다6. 그러나, 과잉 ROS는 조혈 줄기 및 전구 풀의 DNA 손상, 세포 분화 및 고갈과 관련이 있다. 또한 레독스 생물학에 있는 변경백혈병과 건강한 세포 사이에서 다를 수 있다는 기록이 있습니다. 예를 들어, ROS 수준은 그들의 건강한 대조물의 대조와 다른 연구에 비해 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포에서 더 높은 경향이 백혈병 줄기 세포생존을 위한 ROS의 낮은 정상 상태 수준을 유지한다는 것을건의했습니다 7,8. 중요한 것은, 이러한 산화물의 차이를 치료적으로 활용하기 위한 전략은 몇몇 인간적인 암 조정9,10에서약속을 보여주었습니다. 그러므로, 마우스 모형에 있는 ROS 수준의 평가를 허용하는 분석제는 이 종이 세포 생리학 및 질병 병인에 어떻게 기여하는지의 우리의 이해를 향상할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적으로 의 효과를 평가하기 위한 발판을 제공할 수 있습니다 새로운 레독스 표적 항암 치료.
Protocol
Representative Results
Discussion
ROS의 검출을 위해 개발된 형광 염료는 현미경 검사법또는 살아있는 세포에서 유세포분석법22에의해 고정된 세포에서 자주 평가된다. 미토콘드리아 ROS 형광 염료를 사용하여 BM 세포에서 미토콘드리아 ROS의 유세포측정 평가는 두 가지 주요 장점을 가지고 있습니다: 1) 살아있는 세포 분석에 적합한 빠르고 간단한 기술이며 2) 희귀를 구별하고 분석할 수 있습니다. 표면 마커 염색?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 폭스 체이스 암 센터 이사회 (DDM), 혈액학 학자 상 (SMS), 미국 암 학회 RSG (SMS) 및 국방부 (수상 번호: W81XWH-18-1-0472)에 의해 지원되었다.
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Riferimenti
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