Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9
Summary
Describimos un método para utilizar citometría de flujo multiparámetro para detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) en células hematopoyéticas sanas murinas (HSCCP) y células de leucemia a partir de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (LMA) impulsada por MLL-AF9.
Abstract
Presentamos un enfoque citométrico de flujo para analizar la ROS mitocondrial en varias poblaciones de células madre y progenitoras derivadas de médula ósea viva (BM) de ratones sanos, así como ratones con LMA impulsados por MLL-AF9. Específicamente, describimos un proceso de tinción celular de dos pasos, por el que las células BM sanas o leucemias se tiñen primero con un tinte fluorogénico que detecta superóxidos mitocondriales, seguido de la tinción con anticuerpos monoclonales vinculados al fluorocromo que se utilizan para distinguir varias poblaciones de progenitores hematopoyéticos sanos y malignos. También proporcionamos una estrategia para adquirir y analizar las muestras por citometría de flujo. Todo el protocolo se puede llevar a cabo en un período de tiempo tan corto como 3-4 h. También destacamos las variables clave a tener en cuenta, así como las ventajas y limitaciones de la monitorización de la producción de ROS en el compartimiento mitocondrial de las subpoblaciones de tallo y progenitores hematopoyéticos vivos y de leucemia utilizando colorantes fluorogénicos por citometría de flujo . Además, presentamos datos de que la abundancia de ROS mitocondrial varía entre subpoblaciones de HSPC sanas distintas y progenitores de leucemia y analizamos las posibles aplicaciones de esta técnica en la investigación hematológica.
Introduction
Las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) son moléculas altamente reactivas derivadas del oxígeno molecular. La ubicación celular más bien definida de la producción de ROS es las mitocondrias, donde los electrones que pasan a través de la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la fosforilación oxidativa (OXPHOS) son absorbidos por el oxígeno molecular que conduce a la formación de un específico tipo de ROS llamado superóxidos1. A través de las acciones de una serie de enzimas, llamadas dismutas de superóxido o SOD, los superóxidos se convierten en peróxidos de hidrógeno, que posteriormente son neutralizados en agua por enzimas como la catalasa o glutatión peroxidasas (GPX). Las perturbaciones en los mecanismos reguladores de ROS pueden conducir al exceso de producción de ROS, a menudo conocido como estrés oxidativo, que tienen consecuencias celulares dañinas y potencialmente letales como daño a macromoléculas (es decir, ADN, proteínas, lípidos). Además, el estrés oxidativo está relacionado con varias patologías, como diabetes, enfermedades inflamatorias, envejecimiento y tumores2,3,4. Para mantener la homeostasis redox y prevenir el estrés oxidativo, las células poseen una variedad de mecanismos reguladores de ROS5.
Los niveles fisiológicos de ciertos ROS son necesarios para la hematopoyesis embrionica y adulta adecuada6. Sin embargo, el exceso de ROS se asocia con daño al ADN, diferenciación celular y agotamiento del tallo hematopoyético y la piscina de progenitoras. También hay evidencia de que las alteraciones en la biología redox pueden diferir entre la leucemia y las células sanas. Por ejemplo, los niveles de ROS tienden a ser más altos en las células de leucemia mieloide aguda (LMA) en relación con sus contrapartes sanas y otros estudios han sugerido que las células madre de la leucemia mantienen un bajo nivel de estado estacionario de ROS para la supervivencia7,8. Es importante destacar que las estrategias para capitalizar terapéuticamente estas diferencias redox han demostrado ser prometedoras en varios entornos de cáncer humano9,10. Por lo tanto, los ensayos que permiten la evaluación de los niveles de ROS en los modelos de ratón pueden mejorar nuestra comprensión de cómo estas especies contribuyen a la fisiología celular y la patogénesis de la enfermedad, así como potencialmente proporcionar una plataforma para evaluar la eficacia de nuevas terapias contra el cáncer dirigidas al redox.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los colorantes fluorogénicos que se han desarrollado para la detección de ROS se evalúan con frecuencia en células fijas mediante microscopía o en células vivas mediante citometría de flujo22. La evaluación citométrica de flujo de ROS mitocondrial en células BM utilizando colorantes fluorogénicos MItocondrial es ROS tiene dos ventajas principales: 1) Es una técnica rápida y sencilla que es adecuada para el análisis de células vivas y 2) permite distinguir y analizar raras poblacione…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Junta Directiva del Centro Oncológico Fox Chase (DDM), el American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) y el Department of Defense (Premio: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Riferimenti
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