Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.
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Articolo metodologico
Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vi presentiamo un approccio citometrico a flusso per analizzare il ROS mitocondriale in varie popolazioni di cellule staminali e progenitrici derivate da mandorone vivo (BM) da topi sani e topi con AML guidati da MLL-AF9. In particolare, descriviamo un processo di colorazione delle cellule in due fasi, in base al quale le cellule BM sane o leucemia vengono prima macchiate con un colorante fluorogenico che rileva i superossidi mitocondriali, seguito dalla colorazione con anticorpi monoclonali fluoromemici che vengono utilizzati per distinguere varie popolazioni di progenitori ematopoietici sani e maligni. Forniamo anche una strategia per l'acquisizione e l'analisi dei campioni per citometria di flusso. L'intero protocollo può essere eseguito in un lasso di tempo Mettiamo inoltre in evidenza le variabili chiave da considerare, nonché i vantaggi e i limiti del monitoraggio della produzione ROS nel compartimento mitocondriale delle sottopopolazioni di stelo e leucemia e progenie vive utilizzando coloranti fluogenici per citometria di flusso . Inoltre, presentiamo dati che l'abbondanza mitocondriale ROS varia tra distinti sottopopolazioni HSPC sani e progenitori di leucemia e discutiamo le possibili applicazioni di questa tecnica nella ricerca ematologica.
Introduzione
Le specie REattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole altamente reattive derivate dall'ossigeno molecolare. La posizione cellulare più ben definita della produzione di ROS è il mitocondria, dove gli elettroni che passano attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante il fosforoostoslazione ossidativa (OXPHOS) vengono assorbiti dall'ossigeno molecolare che porta alla formazione di uno specifico tipo di ROS chiamato superoossidi1. Attraverso le azioni di una serie di enzimi, chiamati disinmutasi di superossido o SOD, i superolisi vengono convertiti in perossidi di idrogeno, che vengono successivamente neutralizzati in acqua da enz....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Fox Chase Cancer Center.
NOT: Il flusso di lavoro del protocollo è suddiviso in 4 parti, come illustrato nella Figura 1 e i reagenti necessari sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Isolamento del midollo osseo (BM)
NOT: I topi di leucemia MLL-AF9 sono stati generati come descritto in precedenza11.
- ....
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Risultati
Presentato è un metodo per analizzare ROS nei mitocondri di più popolazioni progenie leucemia sane e MLL-AF9-esprimente. Figura 1 viene visualizzata una visualizzazione schematica del flusso di lavoro protocollo, che consiste di 4 passaggi principali: 1) isolamento BM dai mouse; 2) colorare le cellule BM con un colorante fluorogenico che riconosce ROS mitocondriale, in particolare superossidi; 3) Colorazione anticorpo marcatore di superficie per delineare varie popolazioni sane e leucemia em.......
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Discussione
I coloranti fluorogenici che sono stati sviluppati per la rilevazione di ROS sono spesso valutati in cellule fisse mediante microscopia o in cellule vive per citometria di flusso22. La valutazione citometrica del flusso del ROS mitocondriale nelle cellule BM che utilizza nodi fluorogeniche MItocondriali ROS ha due vantaggi principali: 1) Si tratta di una tecnica semplice e veloce adatta per l'analisi delle cellule vive e 2) consente di distinguere e analizzare raro a livello di singola cellula nel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), l'American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e dal Department of Defense (Award: W81XWH-18-1-0472).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Inattivato a caldo FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Terreni |
| Penicillina Streptomicina | Corning | 30-002-CI | Terreni |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Tampone |
| 15 mL provetta conica | BD falcon | 352096 | Forniture per colture tissutali |
| Provetta conica da 50 mL | BD falcon | 352098 | Tissue Forniture per colture |
| 40 μ filtri per cellule m | Fisher Scientific | 22-363-547 | Forniture per colture tissutali |
| Tampone per lisi RBC | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Forniture per colture tissutali |
| Menadione bisolfito di sodio | Sigma aldrich | M5750 | Pro-ossidante |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | |
| Antiossidante CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | anticorpo |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Anticorpo |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Anticorpo |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Anticorpo |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Anticorpo |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Anticorpo |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Anticorpo |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Anticorpo |
| CD117 Clone APC-Cy7 2B8 | Biolegend | 105825 | Anticorpo |
| Sca1 peacifico Clone blu D7 | Biolegend | 108120 | Anticorpo |
| CD150 Clone APC TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Anticorpo |
| CD34 Clone FITC RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Anticorpo |
| CD45.2 Clone APC 104 | Biolegend | 1098313 | Anticorpo |
| MitoSOX | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| Mitotracker | Colorante verde ThermoFisher Scientific | M7514 | Colorante |
| giallo vivo/morto Colorante ThermoFisher | Scientific | L34967 |
Riferimenti
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A.
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Ristampe e permessi
