Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi
Summary
Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.
Abstract
Sağlıklı farelerin yanı sıra MLL-AF9 tarafından yönlendirilen AML’li farelerden elde edilen çeşitli canlı kemik iliği (BM) kaynaklı kök ve ata hücre popülasyonlarında mitokondriyal ROS’u analiz etmek için akış sitometrik bir yaklaşım sitometrik bir yaklaşım sintometrik olarak sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sinat ıyoruz. Özellikle, sağlıklı veya lösemi BM hücrelerinin ilk olarak mitokondriyal süperoksitleri tespit eden florojenik boya ile boyandığı ve ardından florokrom bağlantılı monoklonal antikorlarla boyandığı iki aşamalı bir hücre boyama işlemini tanımlıyoruz. çeşitli sağlıklı ve malign hematopoetik döl popülasyonlarını ayırt etmek. Ayrıca, akış sitometrisi ile numunelerin elde edilip analiz edilebisbir strateji sitometrisi sağlarız. Tüm protokol 3-4 saat gibi kısa bir zaman diliminde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, akış sitometrisi ile florojenik boyalar kullanan canlı hematopoetik ve lösemi sapı ve progenitor alt popülasyonlarının mitokondriyal bölmesinde ROS üretiminin izlenmesinin avantajları ve sınırlamaları gibi önemli değişkenleri de vurguluyoruz. . Ayrıca, mitokondriyal ROS bolluğunun farklı sağlıklı HSPC alt popülasyonları ve lösemi ataları arasında değiştiğine dair veriler sunmakta ve hematolojik araştırmalarda bu tekniğin olası uygulamalarını tartışılmaktadır.
Introduction
Reaktif Oksijen Türleri (ROS) moleküler oksijenden elde edilen yüksek reaktif moleküllerdir. ROS üretiminin en iyi tanımlanmış hücresel konumu, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sırasında elektron taşıma zincirinden (ETC) geçen elektronların belirli bir oluşumuna yol açan moleküler oksijen tarafından emildiği mitokondridir. süperoksit ler1olarak adlandırılan ROS türü. Süperoksit dismutazveya SOD siyonları olarak adlandırılan bir dizi enzimin eylemleri sayesinde, süperoksitler hidrojen peroksitlere dönüştürülür ve bunlar daha sonra katalaz veya glutatyon peroksidaz (GPX) gibi enzimler tarafından suya nötralize edilir. ROS düzenleyici mekanizmalardaki pertürbasyonlar, makromolekül hasarı (DNA, protein, lipidler) gibi zararlı ve potansiyel olarak ölümcül hücresel sonuçlara sahip oksidatif stres olarak adlandırılan ROS’un aşırı üretimine yol açabilir. Ayrıca, oksidatif stres diyabet, inflamatuar hastalıklar, yaşlanma ve tümörler2,3,4gibi çeşitli patolojiler ile ilgilidir. Redoks homeostazını korumak ve oksidatif stresi önlemek için, hücreler çeşitli ROS düzenleyici mekanizmalara sahip5.
Uygun embriyonik ve erişkin hematopoyon için bazı ROS fizyolojik düzeyleri gereklidir6. Ancak, aşırı ROS DNA hasarı ile ilişkilidir, hücresel farklılaşma ve hematopoetik kök ve ata havuzu yorgunluk. Redoks biyolojisindeki değişikliklerin lösemi ve sağlıklı hücreler arasında farklılık gösterdiğine dair kanıtlar da vardır. Örneğin, ROS düzeyleri akut miyeloid lösemi (AML) hücrelerinde sağlıklı muadillerine göre daha yüksek olma eğilimindedir ve diğer çalışmalar lösemi kök hücrelerinin hayatta kalmak için ROS düşük sabit devlet düzeyini korumak olduğunu ileri sürmüşlerdir7,8. Daha da önemlisi, terapötik bu redoks farklılıkları yararlanmak için stratejiler çeşitli insan kanseri ortamlarında umut göstermiştir9,10. Bu nedenle, fare modellerinde ROS düzeylerinin değerlendirilmesine olanak sağlayan tahliller, bu türlerin hücresel fizyoloji ve hastalık patogenene nasıl katkıda bulunduklarına dair anlayışımızı geliştirebilir ve potansiyel olarak yeni redoks hedefleyen anti-kanser tedavileri.
Protocol
Representative Results
Discussion
ROS tespiti için geliştirilen florojenik boyalar sabit hücrelerde sıklıkla mikroskopi veya canlı hücrelerde akış sitometrisi22ile değerlendirilir. Mitokondriyal ROS florojenik boyalar kullanılarak BM hücrelerinde mitokondriyal ROS akış sitometrik değerlendirilmesi iki önemli avantajı vardır: 1) Canlı hücre analizi için uygun hızlı ve basit bir tekniktir ve 2) nadir ayırt ve analiz sağlar yüzey marker boyama kullanarak BM’de tek hücredüzeyinde popülasyonlar. Burada sunu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fox Chase Kanser Merkezi Yönetim Kurulu (DDM), Amerikan Hematoloji Bilginleri Derneği Ödülü (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) ve Savunma Bakanlığı (Ödül#: W81XWH-18-1-0472) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Riferimenti
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
