Denne protokollen illustrerer en celle innkapsling metode ved rask fysisk gelation av alginat til nakkens celler. Innhentet mikroperler tillate kontrollert og vedvarende sekresjon av amyloid-β over tid og kan brukes til å studere effekten av utskilles amyloid-β in vitro og in vivo-modeller.
Ifølge amyloid kaskade hypotese, den tidligste utløser i utviklingen av Alzheimers sykdom (AD) er akkumulering av giftige amyloid-β (Aβ) fragmenter, til slutt fører til de klassiske funksjonene i sykdommen: amyloid plaketter, neurofibrillary floker og Synaptic og neuronal tap. Mangelen på relevante ikke-transgene prekliniske-modeller som reflekterer sykdomsprogresjon er en av de viktigste faktorene som hindrer oppdagelsen av effektive legemiddel behandlinger. For dette formål har vi utviklet en protokoll for fabrikasjon av alginat mikroperler inneholder amyloid-sekresjon celler nyttig for studiet av virkningene av kronisk Aβ produksjon.
Kinesisk hamster eggstokk celler tidligere transfekterte med en menneskelig APP genet, sekresjon Aβ (dvs. 7PA2 celler), ble brukt i denne studien. En tredimensjonal (3D) in vitro-modell for den vedvarende utgivelsen av Aβ ble fabrikkert ved innkapsling av 7PA2-celler i alginat. Prosessen ble optimalisert for å målrette en perle diameter på 500-600 μm for videre in vivo studier. Optimalisering av 7PA2 celle innkapsling i alginat ble utført endre fabrikasjon parametere, for eksempel, alginat konsentrasjon, gel strømningshastighet, elektrostatisk potensial, hode vibrasjon frekvens, gelling løsning. Nivåer av utskilt Aβ ble analysert over tid og sammenlignet mellom alginat perler og standard cellekultur metoder (opp til 96 h).
En konsentrasjon på 1,5 x 106 7PA2 celler/ml og en alginat konsentrasjon på 2% (w/v) BUFRET med HEPES og påfølgende gelation i 0,5 M kalsiumklorid i 5 min ble funnet å dikte den mest stabile mikroperler. Fabrikkert mikroperler var 1) av uniform størrelse, 2) med en gjennomsnittlig diameter på 550 μm, 3) som inneholder ca 100-150 celler per microbead og 4) i stand til å skille Aβ.
Avslutningsvis kan vår optimaliserte metode for produksjon av stabile alginat mikroperler som inneholder amyloid 7PA2 celler muliggjøre modellering av viktige aspekter ved AD både in vitro og in vivo.
Modellering nevrodegenerative sykdom er utfordrende på grunn av komplekse og intrikate natur i hjernen. I Alzheimers sykdom (AD), den progressive tap av Synaptic funksjon og død neurons antas å være en nedstrøms effekt av vedvarende overproduksjon og akkumulering av amyloid beta (Aβ) peptider etter unormal behandling av amyloid forløper protein (APP) i henhold til amyloid kaskade hypotese1.
For å forstå mekanismene av denne amyloid-indusert patologi og å bistå i identifisering av romanen behandling mål, forskere har utviklet ulike in vivo prekliniske modeller. En kategori av modeller benytter en bolus injeksjon av en syntetisk Aβ peptid inn i Rat Brain2,3,4. Den viktigste begrensningen av slike modeller er at de er avhengige av en enkelt-punkt eller gjentatte behandlinger med Aβ peptider i høye konsentrasjoner avsatt alt på en gang. Dette er uforenlig med den kroniske, vedvarende natur utgivelsen av Aβ i sykdom5. En annen kategori av in vivo-modeller er transgene Animal-modeller som uttrykker en eller flere genetiske mutasjoner knyttet til familiær variantene av sykdommen6,7,8,9, 10. men siden FAMILIÆR ad bare står for færre enn 5% av alle Alzheimers tilfeller11, relevansen av disse modellene i å oversette til sporadiske ad hos mennesker er tvilsom12. En annen ulempe med transgene-tilnærmingen er den akselererte Aβ-formasjonen fra fødselen, som kan oversettes til underskudd i kognitiv funksjon og patologiske forandringer for raskt og aggressivt til å ligne sykdomsprogresjon i sporadiske AD hos pasienter12 . For eksempel produserer 5x FAD-modellen plaketter i så lite som 1,5 måneder13.
Interessant, begge disse kategoriene resultere i endringer i kognitiv funksjon relevans til ad Research2, 3,4,5,6, og noen ganger de er ledsaget av utseende av patologiske kjennetegn ved sykdommen som amyloid plakk6,8, tau fosforylering og/eller Synaptic og neuronal tap7,9, 14i det. Men mens disse typer modeller kan gi oss et innblikk i virkningene av høye nivåer av amyloid i hjernen, som ofte er forbundet med senere stadier av AD, de ikke klarer å reflektere de tidligere endringene utstilt som svar på den kroniske og vedvarende eksponering for Aβ peptid12, som endret uttrykk for Synaptic markører15 og komponenter i ekstracellulære matrise16. Derfor er det fortsatt behov for å skape en kronisk modell som mer presist illustrerer virkningene av vedvarende Aβ sekresjon på in vivo kognisjon og illustrerer endringer i patologi.
For dette formål har vi utviklet et system som gjør at konstant, vedvarende sekresjon av Aβ på en kontrollert måte av immobilizing amyloid-sekresjon celler innen hydrogel mikroperler, som kan senere implantert i den voksne rotte hjernen til å modellere aspekter sporadiske AD.
Alginat var den valgte biomaterialet som den er biokompatible og induserer ikke noen uønskede svar når implantert i vivo17. Celle innkapsling i alginat hydrogeler har vært godt etablert de siste fire ti årene. Det første eksempelet på sin oversettelse til klinikken ble rapportert for behandling av type 1 diabetes mellitus17. Den tidligste rapporten om vellykket innkapsling av holmer Langerhans dateres tilbake til 1980. Transplantasjon av mikroperler som inneholder insulin-sekresjon celler revolusjonerte behandlingsalternativer for diabetiker pasienter som det gjenopprettet bukspyttkjertelen funksjon, eliminerer behovet for insulin injeksjon terapi18. Disse arbeidene rapporterer om hvordan celle innkapsling kan beskytte dem mot eksterne påkjenninger, enten de er mekaniske eller kjemiske. Faktisk alginat perler fungere som en barriere og isolere celler fra omgivelsene bevare sine fenotype, samtidig som tilstrekkelig tilgang til de omkringliggende medier for næringsstoffer og clearance av cellulære biprodukter19. Videre, bruk av alginat tillater Matching av mekaniske egenskaper bløtvev20. Alginat hydrogeler kan stilles til å ha en stivhet på 1-30 kPa, ved ganske enkelt å variere alginat konsentrasjon og krysskobling tetthet20,21. Dette er et viktig aspekt, ikke bare for å opprettholde fenotypiske uttrykk for innkapslet celler in vitro, men også for å unngå eventuelle inflammatoriske effekter etter engraftment in vivo22.
I denne protokollen, 7PA2 celler-en kinesisk hamster eggstokk cellelinje som er stabilt transfekterte med et menneskelig APP V717F mutert gen23 -brukes. Disse cellene produserer kontinuerlig katalysatorer produkter av app, inkludert Aβ1-4224,25, og har blitt brukt til å generere Aβ som et alternativ til syntetisk produksjon i prekliniske, akutt in vivo studier26. Vi beskriver en fabrikasjon metode for immobilizing 7PA2 celler innenfor “Soft” alginat mikroperler, designet for å tillate vedvarende sekresjon av biomolekyler. Som et bevis på konseptet, rapporterer vi om utgivelsen av Aβ1-42 peptid over tid. Alginat som brukes er en lav viskositet alginat med en molekylvekt på 120000-190000 g/mol og en mannuronic til guluronic ratio på 1,56 (M/G).
I videre studier, disse mikroperler kan trygt transplantert innenfor regioner av rotte hjernen relevans til AD (f. eks hippocampus) for å studere effekten av kroniske Aβ sekresjon på atferd i vivo og patologi ex vivo. I tillegg kan dette systemet brukes til å studere effekten av kronisk Aβ utgivelse i in vitro-og ex vivo-applikasjoner. For eksempel kan 7PA2-inneholdende alginat mikroperler være co-kultivert in vitro med neuronal eller astrocytic kulturer for å vurdere effekten av kronisk Aβ eksponering på cellulære mekanismer knyttet til AD. Videre kan denne metoden brukes til å undersøke sammenhengen mellom kronisk Aβ produksjon og langsiktige potensiering i ex vivo elektrofysiologi.
Høydepunktet i denne protokollen er den modulære og fleksibiliteten i fabrikasjon metoden, som gjør at fabrikasjon av alginat perler med en mål dimensjon ved finjustering fabrikasjon parametere. Avhengig av programmet, kan protokollen justeres for å få skreddersydde mål med hensyn til microbead størrelse, tetthet av innkapslet celler, og microbead stivhet. Denne protokollen kan brukes for innkapsling av en rekke celletyper, utvikle mer relevante tredimensjonale (3D) in vitro-modeller for å studere ulike patologi. Vi har nylig rapportert om hvordan alginat-innkapslet celler kan brukes til å modellere tidlige stadier av kreft progresjon20.
Konseptet med innkapsling prosessen er basert på ekstrudering av en laminær stråle av celler suspendert i alginat løsning gjennom en dyse. Et vibrerende hode forstyrrer strålen med en kontrollert frekvens som resulterer i like store alginat dråper. En ekstern elektrisk felt tillater separasjon av dannet alginat-baserte dråper, som ved kontakt med en løsning beriket med divalent ioner, slik som kalsium ioner, kan raskt kryss-kobling, bevare deres sfærisk form. Inkubasjons i gelation løsningen tillater dannelse av sfæriske mikroperler som inneholder celler i en homogen fysisk hydrogel27. Målstørrelsen på mikroperler og alginat hydrogeler tillater næringsstoffers og oksygen utveksling med cellekultur Media over lengre tid (uker). Figur 1 A Vis en skjematisk fremstilling av innkapsling apparatet som brukes (figur 1B).
Figur 1 : Innkapsling systemet. (A) skjematisk fremstilling av innkapsling systemet. En alginat er lagt i en sprøyte (2) og matet gjennom et reservoar ved en ekstrudering hastighet satt ved sprøyte pumpe (1). I reservoaret vibrerer en vibrasjons lue (3) ved en frekvens som er satt av en bølgeform generator (4) for å forstyrre strømmen ved like intervaller, og danner like store dråper. Ettersom oppløsningen mates gjennom en dyse (5) og dråper dannes, påføres en elektrostatisk potensial over en elektrode (7) satt av en spennings generator (6), som litt lader overflaten av dråpene, slik at bekken til å spre seg som følge av repelling elektrostatiske krefter. Som dråper engasjere seg med gelation bad (8), ca2 +-drevet krysskobling av alginat resulterer i dannelsen av sfæriske mikroperler. (B) fotografi av innkapsling før fabrikasjon av alginat mikroperler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Microbead størrelse kan endres avhengig av tiltenkt bruk. For å kontrollere størrelsen på microbead, de ulike parametrene som er skissert i figur 1A og i protokollen justeres tilsvarende. Den innvendige diameteren av munnstykket som brukes har en betydelig innvirkning på størrelsen på dråpene; ytterligere justere innkapsling parametere, nemlig ekstrudering hastighet, vibrasjonsfrekvens og spenning, er nøkkelen til å oppnå en konsistent størrelsesfordeling. Bord 1 skisserer hvordan de ulike parametrene kan endre størrelsen på mikroperler oppnådd med dette systemet.
Parameteren | Dyse størrelse | Vibrasjonsfrekvens | Strømningshastighet | Elektrode spenning |
Perle størrelse | – |
Tabell 1: Fabrikasjon parametere og deres innflytelse på microbead størrelse. Tabellen illustrerer hvordan hver parameter kan påvirke resulterende størrelsen på fabrikkert mikroperler, uavhengig av munnstykket og viskositet av løsningen som brukes.
Metoden som er beskrevet i denne artikkelen er nyttig for innkapsle celler oppnå en smal størrelsesfordeling av alginat mikroperler27. Den gir også fordelen av voksende celler i et Immuno-isolert miljø17,19, beskytte dem mot ytre stress. I tillegg etterligner innkapsling av celler i alginat nærmere fysiologiske forhold, spesielt med hensyn til celle-til-celle interaksjoner og matrise stivhet20. Disse faktorene er alle spesielt avgjørende for senere bruk i relevante anvendelser, slik som in vivo engraftment, utelukker potensielle immunreaksjoner i det omkringliggende vevet17. Videre er en stor fordel med denne protokollen er enkel tuneability i henhold til anvendelse av interesse: det er mulig å endre protokollen og optimalisere parametrene for fabrikasjon av større eller mindre, og mykere eller stivere perler. Den beskrevne metoden brukes til å dikte perler små nok til å bli injisert med minimalt invasive metoder, og tilstrekkelig stor nok til å være vert for en rekke celler og gi en tilstrekkelig frigjøring av Aβ å resultere i Observer atferdsmessige og patologiske effekter ved injeksjon i dyremodeller.
Suksessen til denne protokollen er avhengig av en rekke kritiske trinn. Forsiktig celle håndtering og optimale celle dyrking teknikker er viktig for å opprettholde celle levedyktighet og funksjon20,28. Ved hjelp av standard kultur forhold sikrer bevaring av normal funksjon av 7PA2 celler, som observert. Dette gjør at en lignende Release profil for Aβ1-42 fra innkapslet celler sammenlignet med 2D kulturer. I tillegg, for at protokollen skal fungere optimalt, garanterer en alginat løsning med lav viskositet bedre resultater sammenlignet med en alginat løsning med høy viskositet. Dette sikrer at en homogen laminær Jet er ekstrudert gjennom munnstykket og en jevn fordeling av celler i matrisen av fabrikkert perler27. Materialer som brukes til kapsler celler må ha en svært rask gelation mekanisme, slik at oppbevaring av formen.
Et annet kritisk skritt i denne protokollen er håndteringen av fabrikkert mikroperler følgende gelation. Her viser vi henting av mikroperler ved hjelp av en stor blenderåpning plast pipette å overføre perlene. Alternativt, helle kalsiumklorid oppløsning som inneholder mikroperler i et mesh filter kan brukes til perle henting. En stor (5, 10 eller 25 mL) serologisk pipette kan brukes til å trekke opp mikroperler og deretter vaskes gjennom mesh filter i stedet for pouring. Fordelen med dette er en høyere tillit til sterilitet av prosedyren i forhold til pouring. Men av begrensningene er at noen perler kan bli forvrengt hvis de er komprimert av pipette, i tillegg til å risikere en lavere avkastning hvis en stor andel av mikroperler ikke er reddet.
Denne tilnærmingen har blitt brukt til å kapsler forskjellige cellelinjer til å modellere og studere ulike sykdommer (f. eks, frigjøring av insulin fra innkapslet bukspyttkjertel Holme). Nyheten av vår tilnærming er engraftment av mikroperler generert ved hjelp av denne protokollen som en nyttig metode i modellering viktige aspekter ved Alzheimers sykdom in vivo. Ved sammenligning av Release profilen til Aβ fra innkapslet celler (Figur 4) til nivåene av Aβ generert av en bolus injeksjon (slik som som rapportert i andre studier3,26), en mer kronisk og vedvarende frigjøring av Aβ kan Forventet. Figur 6 illustrerer den anslåtte tendensen som kan oppnås. Bruk av dette systemet for in vivo modellering er mer relevant for hvordan sykdommen utvikler seg og kan være mer nyttig i stoffet oppdagelse og utvikling.
Figur 6 : Anslått Release profil av Aβ1-42 fra innkapslet 7PA2 celler sammenlignet med en bolus injeksjon. Profilen av Aβ utgivelse fra engrafted 7PA2-inneholdende mikroperler tillater testing av virkningene av kroniske og vedvarende Aβ i et dyr modell av relevans til AD. Motsatt, en bolus injeksjon vil skape en topp i Aβ nivåer over en kort periode, etterfulgt av en rask clearance av Aβ fra hjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Mr Kajen Suresparan, Dr Jonathan Wubetu, Mr Dominik Grudzinski, Miss Chen Zhao, og Dr. Thierry pilot for deres hjelp i optimalisering av alginat microbead fabrikasjon, cellekultur og Aβ deteksjon, og nyttig vitenskapelig Diskusjoner.
µManager software | Vale Lab, UCSF, USA | v.1.46 | |
0.22 um PES filter | Merck, UK | SLGP033RS | |
15mm Netwell insert 74 um mesh filter | Constar, usa | #3477 | |
Alginic acid sodium salt from brown algae | Sigma-Aldrich,uk | A0682 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich,uk | C1016 | |
CellTiter96 AQueous One Solution cell proliferation assay | Promega, USA | G3580 | |
Encapsulator | Inotech | IE-50 | serial no. 05.002.01-2005 |
HEPES | Sigma-Aldrich,uk | H4024 | |
Hu Aβ 1-42 ELISA | ThermoFisher, UK | KHB3441 | |
ImageJ software | ImageJ | v1.49p | |
Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | |
Leica microscope | Leica microsystems, UK | DMI6000B | |
Neo sCMOS Camera | Ander, UK | 5.5 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,uk | D1408 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich,uk | 433209 | |
Trispdium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich,uk | W302600-K | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich,uk | T4049 |