Denne metode beskriver en kronisk forberedelse, der giver optisk adgang til hippocampus af levende mus. Denne forberedelse kan bruges til at udføre langsgående optisk billeddannelse af neuronal strukturel plasticitet og aktivitet-fremkaldt cellulær plasticitet over en periode på flere uger.
To-foton mikroskopi er et grundlæggende redskab for neurovidenskab, da det tillader undersøgelse af hjernen af levende dyr på rumlige skalaer spænder fra subcellulære til netværk niveauer og på tidsmæssige skalaer fra millisekunder til uger. Desuden kan to-photon Imaging kombineres med en række adfærdsmæssige opgaver for at udforske årsagssammenhæng mellem hjernefunktion og adfærd. Men, i pattedyr, begrænset penetration og spredning af lys har begrænset to-photon intravital Imaging mest til overfladiske hjerneområder, således udelukker langsgående undersøgelse af dybe hjerneområder som hippocampus. Hippocampus er involveret i rumlig navigation og episodisk hukommelse og er en mangeårig model, der bruges til at studere cellulære såvel som kognitive processer, som er vigtige for indlæring og tilbagekaldelse, både i sundhed og sygdom. Her er et præparat, der giver mulighed for kronisk optisk adgang til dorsale hippocampus i levende mus, detaljeret. Denne forberedelse kan kombineres med to-foton optisk billeddannelse ved cellulære og subcellulære opløsning i hoved fast, bedøvet levende mus over flere uger. Disse teknikker muliggør gentagen billeddannelse af neuronal struktur eller aktivitet-fremkaldt plasticitet i titusinder til hundredvis af neuroner i dorsale hippocampus Carnot. Desuden kan denne kroniske præparat anvendes i kombination med andre teknikker såsom mikro-endoskopi, hoved-monteret bred felt mikroskopi eller tre-photon mikroskopi, således i høj grad udvide værktøjskassen til at studere cellulære og netværksprocesser involveret i indlæring og hukommelse.
I pattedyr er hippocampus en vigtig hjerneregion for kodning og tilbagekaldelse af episodiske minder samt for rumlig navigation1,2,3,4. Af denne grund, hippocampus har været-og stadig er-en meget vigtig model til at studere de grundlæggende mekanismer, der gør det muligt for hjernen at indkode og huske erindringer5,6,7 eller til at navigere i et miljø8 ,9 indsamle belønninger og undgå farer. Desuden er den hippocampale dannelse en af de hjerneregioner, hvor nye neuroner genereres i hele livet af gnavere10,11 og muligvis af mennesker12,13. Endelig er degeneration eller svækkelse af hippocampus dannelse forbundet med neurologiske og psykiske lidelser, herunder Alzheimers sygdom14.
I mus ligger hippocampus ca. 1 mm under hjerne overfladen15. Dens position har forhindret optisk adgang i den intakte hjerne, og derfor har langsgående studier af hippocampus dynamik hovedsagelig været baseret på magnetisk resonans (MR) Imaging, Elektrofysiologi og ex vivo billeddannelse analyser. MR Imaging metoder tillader sporing af biologiske processer (f. eks, genekspression ændringer16) i det samme dyr over flere dage, men mangler den rumlige opløsning til at diskriminere enkelt neuroner. Klassiske in vivo elektrofysiologiske teknikker tilbyder meget høj tidsmæssig opløsning og udsøgt følsomhed over for ændringer i membranpotentialet. Men de har en begrænset geografisk opløsning, og de mangler evnen til pålideligt at spore de samme celler over længere tidsperioder. Optisk billeddannelse gør det muligt at undersøgt mere forskelligartede processer i kraft af dens høje tidsmæssige og rumlige opløsninger. Men ex vivo Imaging giver kun snapshots af igangværende processer, og det er derfor ikke egnet til langsgående undersøgelser, hvor dyrene lærer og husker oplysninger.
In vivo optisk billeddannelse kombinerer nogle fordele ved MR Imaging og Elektrofysiologi med dem af optisk billeddannelse. Derfor er det meget velegnet til langsgående og korrelative analyser af muse hjernens dynamik og opførsel. Dette er relevant i undersøgelser af biologiske processer med meget hurtig (millisekunder til sekunder) eller meget langsom (dage til uger) tidsskalaer. Eksempler på sådanne processer, der er relevante for neurovidenskab er membranspænding dynamik, ca2 + transienter, cellulære plasticitet og strukturelle ændringer, som alle menes at være meget vigtigt for hukommelse dannelse og tilbagekaldelse. Forskellige metoder har udvidet in vivo Imaging til dorsale hippocampus18,19,20,21,22. Akutte præparater har gjort det muligt at spore pyramide neuron (PN) aktivitet samt deres dendritter og dendritiske spines i flere timer20,22. Denne tidsmæssige tidsramme tillader imidlertid ikke langsigtede strukturelle ændringer, som kan ligge til grund for en trinvis læring, der skal undersøgt. Kroniske præparater-i kombination med mikro-endoskoper23,24 eller med lang arbejdsdistance (WD) standard mikroskop mål21 -har muliggjort gentagen billeddannelse af dorsale hippocampus over flere Uger.
Her beskriver vi en kronisk forberedelse, der giver recidiverende optisk adgang til det under felt i CARNET’S dorsale hippocampus af levende mus ved hjælp af en permanent indsat billed kanyle. Dette præparat giver mulighed for gentagen adgang til CAREJEN uden funktionel forstyrrelse og er egnet til intravital to-foton (2P) eller bred-felt epifluorescens Imaging. To eksempler på 2P dyb hjerne kronisk billeddannelse i rygmarven af levende mus er detaljeret: langsgående billeddannelse af dendritiske struktur og dendritiske rygsøjlen dynamik og langsgående billeddannelse af aktivitet-fremkaldt plasticitet. De vigtigste fordele og begrænsninger af teknikken diskuteres.
Her beskrives en procedure for gentagen 2P-afbildning af dorsale-Carmen i levende mus. Efter operationen, musen normalt genindvinder inden for 2 dage. Proceduren inducerer minimal astrogliosis26,43. Blødning og ødem, som kan følge operationen er normalt re-adsorbede inden for 10 til 14 dage. Generelt, fra 14 dage efter implantation og fremefter præparatet er tilstrækkeligt klart til at udføre intravital Imaging. Succesen af operationen afhænger ikke af at arbejde i et sterilt miljø. Men, det er afgørende at opretholde en høj grad af hygiejne, for at undgå komplikationer på grund af kirurgi-associerede infektioner. Dette opnås ved omhyggeligt at rense de kirurgiske instrumenter før og efter operationen og ved at varme-sterilisere dem umiddelbart før hver brug (trin 2.1.1). Den optiske kanyle holdes i en ren, steriliseret beholder og skylles med sterilt saltvand lige før implantationen. Udførelse af almindelige kirurgiske praksis af hænder desinfektion og rengøring af kirurgisk Station er også meget vigtigt. Præparatet forbliver stabilt og tillader cellulære og subcellulære opløsning Imaging i flere uger26,35.
Kritiske trin, modifikationer og fejlfinding.
Det er vigtigt at skrælle den udvendige kapsel, indtil de dybeste fibre er eksponeret. Undladelse af at udsætte alveus kan resultere i manglende evne til at fokusere på Soma af PNS, eller i reduceret opløsning Imaging dendritiske spines, når du bruger kommercielle mål med 3-eller 4-mm WD. Til dette formål, det er nyttigt at afsmelte neocortex meget langsomt ved hjælp af en 0,9 mm diameter nål og derefter skifte til en 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) nål for en finere kontrol af sugning, når du fjerner de mest rygfibre. Alternativt kan fine pincet anvendes til at fjerne den resterende cortex efter fiber eksponering36.
Blødning under kirurgi kan være problematisk, som blod hindrer visningen. Venter på, at blodprop til dannelse og derefter skylning med saltvand til at vaske væk resterende blod anbefales. Gentag om nødvendigt.
En tætsiddende pasform mellem kanyle og kraniotomi hjælper med at øge stabiliteten af præparatet ved at holde kanylen på plads før påføring af cementen, især hvis den ydre rand af kanylen flugter med kraniet. Da størrelserne på trephin-boret og kanylen matches, kan der opstå en løs pasform på grund af uregelmæssigheder på siden af kanylen-som kræver lidt større craniotomier for at passe (Se trin 2.3.14)-eller fra en uregelmæssig kraniotomi. Eventuelle uregelmæssigheder i kanylen skal indgives (trin 1,3 og 1,12), og trefin skal holdes vinkelret på kraniet, indtil kranie ktomi er afsluttet (trin 2.3.12). Fjernelse af trephin fra kraniet før kraniotomi er afsluttet kan resultere i uregelmæssige craniotomier.
Begrænsninger- Invasivitet og stabilitet af præparatet.
Det er vanskeligt at evaluere virkningen af den kortikale ablation, da det er besværligt præcist at definere de områder, der berøres direkte og indirekte. I almindelighed, operationen fjerner en del af parietal cortex og en del af den visuelle og baglemmer sensoriske cortex21. Den ablateret cortex ikke direkte projekt til hippocampus og hippocampus væv er hverken rørt eller såret. Det er vigtigt, at det er påvist, at implantation af en billedbehandlings kanyle ikke groft ændrer hippocampus-funktionen og specifikt hippocampus-afhængig indlæring21,36,37,38, 39. Det vil dog være vigtigt at kvantificere, i hvilket omfang både kanyle og den udvendige del af implantatet (hoved holder pladen og dental akryl hætte) er kroniske stressorer ved at vurdere kortikosterone-blodets indhold og binyrens vægt i forhold til ikke-implanterede mus.
Præparatet er generelt stabilt fra uger til måneder26. På lang sigt har hud-og knoglevækst tendens til at fortrænge akryl hætten og øge ustabiliteten af billedbehandlings præparatet.
Optiske begrænsninger.
Konventionel 2p mikroskopi giver mulighed for billeddannelse op til ca. 1 mm dybt ind i neocortical væv40,41. I overensstemmelse med dette er det muligt at afbilde dendritter og dendritiske Spiner placeret i SR (figur 2D-F) eller SLM36. Men, Imaging gennem en kanyle udgør begrænsninger for den effektive NA. For at opnå den maksimale opløsning, skal diameteren og dybden af billedbehandlings kanylen matches med Imaging NA, da mindre diametre og længere dybder vil klippe lyset af høje NA-mål. For eksempel, når billeddannelse med en 1,0 NA vand nedsænkning mål gennem en 1,6 mm lang kanyle, en 3,65 mm indvendig diameter er nødvendig for at holde den fulde NA. Men ved hjælp af en kanyle af denne diameter vil øge komprimeringen på Hippocampus og kan påvirke sundheden for vævet, af denne grund, vi bruger en kanyle med en mindre diameter. Ved billeddannelse med et 0,8 NA vand nedsænknings formål gennem en 1,6 mm lang kanyle, ville en indvendig diameter på 2,5 mm være tilstrækkelig til at holde den fulde NA. Men, 0,8 NA vand nedsænkning mål har en kortere WD (3 mm i vores tilfælde), som kan forhindre i at fokusere på SP.
Disse beregninger gælder for midten af synsfeltet i bunden af kanyle. Men at flytte billedfeltet synspunkt værts-tættere på kanterne af kanylen-eller fokusere dybere ind i vævet-længere fra glasoverfladen af kanylen-yderligere nedsætter den effektive na på brændplanet og dermed reducerer opløsningen. Dette vil føre til ikke-homogen opløsning på tværs af de forskellige mængder af afbildet væv og kan være en bekymring for kvantitativ billeddannelse ved subcellulære opløsning, især når du bruger Super-resolution teknikker såsom 2p-sted mikroskopi42. Disse spørgsmål er mindre vigtigt, når Imaging på cellulære opløsning.
Vævs bevægelse.
Motion i vævet-stammer fra vejrtrækning og hjerteslag i bedøvet dyr-tendens til at blive mere alvorlig med øget afstand fra billedbehandling kanyle. Dette skyldes muligvis, at billedbehandlings kanylen anvender mekanisk Tryk på hjernen og dermed modvirker en del af bevægelsen i nærheden af kanylen (på samme måde som neokortiske præparater). Selv om billeddannelse af dendritiske spines er muligt i SR og SLM, i vores hænder, er det mest robuste dorsale til så op til ≈ 200 μm fra overfladen af kanylen. For at kompensere for bevægelse bruger vi resonans scannere og offline gennemsnit. Flere billeder (4 til 6 gentagelser) erhverves pr . billed plan for en z-stak ved den maksimale tilgængelige hastighed (30 frames/s). Alle gentagelser for hvert z-fly er derefter devolveret (ved hjælp af kommerciel software, AutoQuant), registreret (ved hjælp af ImageJ) og gennemsnit i et enkelt billede26. For billeddannelse af somata, bevægelse er ofte ubetydelig på anæstesi35 og to gennemsnit er ofte tilstrækkelige til at kompensere for motion artefakter.
Fremtidige anvendelser eller anvisninger af metoden .
Præparatet kan kombineres med mikro-endoskoper26,43. Mikro-endoskoper er stive optiske sonder, som bruger gradient brydnings Index (grin) mikrolinser til at vejlede lys til og fra dybe væv18. Brugen af mikro-endoskoper tillader kanyle af mindre diametre eller endda ingen kanyle overhovedet. Men, kommercielle mikro-endoskoper er mindre godt korrigeret for optiske aberrationer og har lavere NA end kommercielle mål. Nuværende sonder nå laterale og aksiale opløsninger af ≈ 0.6-1 μm, ≈ 10-12 μm, henholdsvis17,18,44. Brugen af mikro-endoskoper giver også mulighed for kombinationen af dette præparat med Hovedmonterede integrerede widefield mikroskoper45,46,47.
Metoden egner sig også til brug i ikke-bedøvede mus, og det er blevet brugt til at undersøge cellulær aktivitet ved hjælp af ca2 + sensorer i vågen hoved-fast mus21,37,48,49. I disse tilfælde, på grund af den hurtige tidsskalaer for fluorescens ændringer, er det tilrådeligt at implementere linje registrering50. Det er også muligt at tilpasse forberedelsen til billeddannelse af andre hippocampus-subregioner såsom dentate gyrus (DG)39,51,52. Kombinere dette præparat med 3p excitation53,54 med 1 MHz frekvens pulserende laser tunet til 1400 nm, vi var i stand til at billedet dybere ind i hippocampale dannelse nå det molekylære lag, granulat celle lag og af Generaldirektoratet (figur 4) uden at fjerne den overliggende
Afslutningsvis præsenterer vi en metode, der giver optisk adgang til dorsale hippocampus og tillader langsgående og korrelative undersøgelser af dynamikken i hippocampus struktur og aktivitet. Denne teknik udvider mulighederne for analyse af hippocampus funktion under fysiologiske og patologiske forhold.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. støttes af Schram Foundation; C.-W. T. P. og W. G. støttes af Max Planck Society; L.Y. og R.Y. understøttes af Max Planck Society og National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. understøttes af et FP7-tilskud fra det europæiske forskningsråd, ERANET-og I-CORE-programmerne, det israelske sundhedsministeriums chefforsker kontor, Forbundsministeriet for uddannelse og forskning, Roberto og Renata Ruhman, Bruno og Simone Lich, Nella og Leon Benoziyo Center for neurologiske sygdomme, Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging og Genomics, Israels Science Foundation Perlman familien, Adelis, Marc Besen, Pratt og Irving I. Moskowitz fundamenter; A. A. støttes af Max Planck Society, Schram Foundation og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 3P-billederne blev erhvervet under det avancerede kursus om Neuro billedbehandlings teknikker på Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Den avancerede kursus om Neuro Imaging teknikker er understøttet af Max Planck Society, Florida State Max Planck Scientific Fellowship program og af Max Planck Florida Institute Corporation partnerskab program. Vi vil gerne takke Thorlabs, sammenhængende og SpectraPhysics for at yde støtte og udstyr til 2P/3P Imaging System i løbet af kurset. Vi er også taknemmelige for Henry HAEBERLE og Melissa Eberle for at hjælpe med systemet i løbet af kurset.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |