Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.
Two-photon microscopie is een fundamenteel hulpmiddel voor Neurowetenschappen, omdat het onderzoek van de hersenen van levende dieren op ruimtelijke schalen mogelijk maakt, variërend van subcellulaire tot netwerk niveaus en op temporele schalen van milliseconden tot weken. Daarnaast kan Two-photon Imaging worden gecombineerd met een verscheidenheid aan gedragstaken om de causale relaties tussen hersenfunctie en gedrag te verkennen. Echter, in zoogdieren, beperkte penetratie en verstrooiing van licht hebben beperkt twee-photon intravital beeldvorming meestal aan oppervlakkige hersengebieden, dus in de richting van longitudinaal onderzoek van diepe hersengebieden zoals de hippocampus. De hippocampus is betrokken bij ruimtelijke navigatie en episodische geheugen en is een lange-staande model gebruikt voor het bestuderen van cellulaire evenals cognitieve processen belangrijk voor het leren en terugroepen, zowel in de gezondheid en de ziekte. Hier is een voorbereiding die chronische optische toegang tot de rughippo campus in levende muizen mogelijk maakt gedetailleerd. Dit preparaat kan worden gecombineerd met twee-photon optische beeldvorming op cellulaire en subcellulaire resolutie in hoofd vaste, verdoofd levende muizen over meerdere weken. Deze technieken maken herhaalde beeldvorming van neuronale structuur of activiteit-Evoked plasticiteit in tientallen tot honderden neuronen in de rughippocampal CA1. Bovendien kan deze chronische voorbereiding worden gebruikt in combinatie met andere technieken zoals micro-endoscopie, hoofd-gemonteerde brede veld microscopie of drie-Fobe microscopie, waardoor de gereedschapskist sterk wordt uitgebreid om cellulaire en netwerkprocessen te bestuderen die betrokken zijn in leren en geheugen.
In zoogdieren, de hippocampus is een belangrijke hersenregio voor de codering en terugroepen van episodische herinneringen, alsmede voor ruimtelijke navigatie1,2,3,4. Om deze reden, de hippocampus is geweest-en is nog steeds-een zeer belangrijk model om de basismechanismen die het mogelijk maken de hersenen om te coderen en terugroepen herinneringen5,6,7 of om te navigeren in een omgeving te bestuderen8 ,9 beloningen verzamelen en gevaren vermijden. Daarnaast is de hippocampal formatie is een van de hersengebieden waar nieuwe neuronen worden gegenereerd gedurende het leven van knaagdieren10,11 en, eventueel, van de mens12,13. Tot slot, degeneratie of aantasting van de hippocampal vorming worden geassocieerd met neurologische en psychiatrische stoornissen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer14.
Bij muizen ligt de Hippocampus ongeveer 1 mm onder het hersen oppervlak15. Zijn positie heeft optische toegang voorkomen in het intacte brein en bijgevolg hebben longitudinale studies van hippocampal Dynamics zich voornamelijk gebaseerd op magnetische resonantie (MR) Imaging, elektrofysiologie en ex vivo imaging analyses. De heer Imaging methodes maken het volgen van biologische processen (bijv. genexpressie wijzigingen16) in hetzelfde dier over meerdere dagen mogelijk, maar missen de ruimtelijke resolutie om enkelvoudige neuronen te discrimineren. Klassieke in vivo elektrofysiologische technieken bieden een zeer hoge temporele resolutie en een uitstekende gevoeligheid voor veranderingen in membraanpotentiaal. Ze hebben echter een beperkte ruimtelijke resolutie en ze missen de mogelijkheid om dezelfde cellen betrouwbaar te volgen gedurende langere perioden. Optische beeldvorming maakt het mogelijk om meer diverse processen te studeren op grond van de hoge temporele en ruimtelijke resoluties. Ex vivo imaging biedt echter alleen snapshots van lopende processen, en is dus niet geschikt voor longitudinale studies waarbij de dieren informatie leren en terugroepen.
Optische beeldvorming combineert in vivo een aantal voordelen van de heer Imaging en elektrofysiologie met die van optische beeldvorming. Daarom is het zeer goed geschikt voor longitudinale en correlatieve analyses van muis hersen dynamiek en gedrag. Dit is relevant in studies van biologische processen met zeer snel (milliseconden tot seconden) of zeer traag (dagen tot weken) tijdschema’s. Voorbeelden voor dergelijke processen die relevant zijn voor de neurowetenschappen zijn membraanspanning dynamiek, CA2 + transiënten, cellulaire plasticiteit en structurele veranderingen, die worden allemaal verondersteld te zijn zeer belangrijk voor Geheugenvorming en terugroepen. Verschillende methodes zijn uitgebreid in vivo imaging naar de dorsale Hippocampus18,19,20,21,22. Acute preparaten hebben het volgen van de activiteit van piramidale neuron (PN), evenals hun dendritische stekels gedurende enkele uren20,22toegestaan. Deze temporele tijdspanne staat echter niet toe dat structurele veranderingen op de lange termijn, die kunnen leiden tot incrementele leerprocessen, worden bestudeerd. Chronische preparaten-in combinatie met micro-endoscopen23,24 of met lange werkafstand (WD) standaard Microscoop doelstellingen21 -hebben herhaalde beeldvorming van de dorsale Hippocampus over verschillende Weken.
Hier beschrijven we een chronische voorbereiding die terugkerende optische toegang biedt tot het CA1-subveld van de dorsale Hippocampus van levende muizen met behulp van een permanent ingevoegde beeldvormings canule. Dit preparaat maakt herhaalde toegang tot de CA1 zonder functionele verstoring en is geschikt voor intravital Two-photon (2P) of breed-veld epifluorescentie beeldvorming. Twee voorbeelden van 2 p diepe hersenen chronische beeldvorming in de dorsale CA1 van levende muizen zijn gedetailleerd: longitudinale beeldvorming van dendritische structuur en dendritische wervelkolom dynamiek en longitudinale beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit. De belangrijkste voordelen en beperkingen van de techniek worden besproken.
Hier wordt een procedure voor herhaalde 2P-beeldvorming van de dorsale CA1 in levende muizen beschreven. Na de operatie herstelt de muis meestal binnen 2 dagen. De procedure induceert minimale Astrogliose26,43. Bloedingen en oedeem die de operatie kunnen volgen, worden meestal binnen 10 tot 14 dagen opnieuw geadsorreven. Over het algemeen is de bereiding vanaf 14 dagen na implantatie voldoende duidelijk om intravital beeldvorming uit te voeren. Het succes van de operatie is niet afhankelijk van het werken in een steriele omgeving. Echter, het is cruciaal om een hoog niveau van hygiëne te handhaven, om complicaties te voorkomen als gevolg van chirurgie-geassocieerde infecties. Dit wordt verkregen door de chirurgische instrumenten voor en na de operatie nauwgezet te reinigen en door ze onmiddellijk voorafgaand aan elk gebruik te verwarmen (stap 2.1.1). De optische canule wordt in een schone, gesteriliseerde verpakking gehouden en vlak voor de implantatie gespoeld met steriele zoutoplossing. Het uitvoeren van gemeenschappelijke chirurgische praktijken van handendesinfectie en reiniging van het chirurgische station is ook erg belangrijk. De bereiding blijft stabiel en maakt cellulaire en subcellulaire resolutie beeldvorming voor enkele weken26,35.
Kritieke stappen, wijzigingen en probleemoplossing.
Het is belangrijk om de uitwendige capsule te schillen tot de diepste vezels worden blootgesteld. Het niet blootleggen van de alveus kan resulteren in het onvermogen om zich te concentreren op het SOMA van PNS, of in gereduceerde resolutie beeldvormende dendritische stekels, bij het gebruik van commerciële doelstellingen met 3-of 4-mm WD. Voor dit doel is het nuttig om de neocortex zeer langzaam te ablaten met een naald van 0,9 mm diameter en vervolgens over te schakelen op een 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) naald voor een fijnere controle van de zuigkracht bij het verwijderen van de meest dorsale vezels. Als alternatief kan Fine Tang worden gebruikt om de resterende cortex te verwijderen na blootstelling aan vezels36.
Bloeden tijdens de operatie kan problematisch zijn, als bloed belemmert het uitzicht. Wachten op het stolsel te vormen en vervolgens spoelen met zoutoplossing om rest bloed te wassen wordt aanbevolen. Herhaal deze indien nodig.
Een nauwsluitende pasvorm tussen de canule en de craniotomie helpt de stabiliteit van het preparaat te verhogen door de canule op zijn plaats te houden vóór het aanbrengen van het cement, vooral als de buitenste rand van de canule met de schedel is uitgelijnd. Omdat de maten van de genoemd boor en de canule worden geëvenaard, kan een losse pasvorm ontstaan door onregelmatigheden aan de zijkant van de canule-die iets grotere craniotomieën nodig hebben om te passen (zie stap 2.3.14)-of van een onregelmatige craniotomie. Eventuele onregelmatigheden bij de canule moeten worden afgezet (stappen 1,3 en 1,12) en de trefine moet loodrecht op de schedel worden gehouden totdat de craniotomie is voltooid (stap 2.3.12). Het verwijderen van de trefine uit de schedel voordat de craniotomie is voltooid kan resulteren in onregelmatige craniotomieën.
Beperkingen- Invasiviteit en stabiliteit van het preparaat.
Het is moeilijk om het effect van corticale ablatie te evalueren, omdat het lastig is om de gebieden die direct en indirect worden getroffen nauwkeurig te definiëren. In het algemeen, de operatie verwijdert een deel van de pariëtale cortex en een deel van de visuele en hindledemaat zintuiglijke cortex21. De ablatie cortex niet direct projecteren op de hippocampus en hippocampal weefsel is niet geraakt noch gewond. Belangrijk is dat het is aangetoond dat implantatie van een beeldvormings canule de hippocampal functie en specifiek de hippocampal-afhankelijke leerproces niet sterk wijzigt21,36,37,38, 39. Toch is het belangrijk om te kwantificeren in hoeverre zowel de canule als het uitwendige deel van het implantaat (hoofd Houderplaat en tandheelkundige acryl dop) chronische stressoren zijn door de bloedspiegels van corticosteron en de bijnier gewicht te beoordelen in vergelijking met ongeimplanteerde muizen.
Het preparaat blijft over het algemeen stabiel van weken tot maanden26. Op de lange termijn, huid-en botgroei neiging om het acryl kapje te verplaatsen en de instabiliteit van de Imaging voorbereiding te verhogen.
Optische beperkingen.
Conventionele 2p microscopie maakt beeldvorming tot ongeveer 1 mm diep in neocorticale weefsel40,41. Consistent met deze, het is mogelijk om te beeld dendrites en dendritische stekels gelegen in de SR (figuur 2D-F) of SLM36. Echter, beeldvorming door middel van een canule vormt beperkingen voor de effectieve NA. Om de maximale resolutie te bereiken, moeten de diameter en diepte van de beeldvormings canules worden afgestemd op de Imaging NA, omdat kleinere diameters en langere diepten licht van hoge NA-doelstellingen zullen clippen. Bijvoorbeeld, bij beeldvorming met een 1,0 NA water onderdompeling doel door een 1,6 mm lange canule, is een 3,65 mm binnendiameter nodig om de volledige NA te houden. Echter, met behulp van een canule van deze diameter zal de compressie op de Hippocampus te verhogen en kan invloed hebben op de gezondheid van het weefsel, om deze reden, gebruiken we een canule met een kleinere diameter. Bij beeldvorming met een 0,8 NA water onderdompeling door middel van een 1,6 mm lange canule, zou een inwendige diameter van 2,5 mm voldoende zijn om het volledige NA te houden. Echter, 0,8 NA water onderdompeling doelstellingen hebben een kortere WD (3 mm in ons geval), die kan voorkomen dat zich te concentreren op de SP.
Deze berekeningen zijn van toepassing op het midden van het gezichtsveld aan de onderkant van de canule. Echter, verplaatsen van het beeldveld van de weergave Sidewise-dichter bij de randen van de canule-of dieper in het weefsel te focussen-verder van het glasoppervlak van de canule-vermindert verder de effectieve NA in het brandvlak en dus vermindert de resolutie. Dit zal leiden tot een niet-homogene resolutie over de verschillende volumes van afbeelding gemaakt weefsel en kan een zorg zijn voor kwantitatieve beeldvorming op subcellulaire resolutie, vooral bij het gebruik van super-resolution technieken zoals 2p-STED microscopie42. Deze problemen zijn minder belangrijk bij Imaging op cellulaire resolutie.
Weefsel beweging.
Beweging binnen het weefsel-afkomstig van ademhaling en hartslag bij verdomde dieren-neigt te worden ernstiger met verhoogde afstand van de Imaging canule. Dit is mogelijk omdat de Imaging canule mechanische druk op de hersenen toepast, waardoor een deel van de beweging in de nabijheid van de canule wordt tegengedraaid (vergelijkbaar met neocorticale preparaten). Dus, hoewel beeldvorming van dendritische stekels mogelijk is in SR en SLM, in onze handen, het is de meest robuuste rug tot de zo tot ≈ 200 μm van het oppervlak van de canule. Om de beweging te compenseren, gebruiken we resonante scanners en offline middeling. Verschillende beelden (4 tot 6 herhalingen) worden per beeldvlak van een z-stack verkregen bij de maximaal beschikbare snelheid (30 frames/s). Alle herhalingen voor elk z-vlak worden vervolgens deconvolved (met behulp van de commerciële software, AutoQuant), geregistreerd (met behulp van ImageJ) en gemiddeld in een enkele afbeelding26. Voorbeeld vorming van somata, beweging is vaak verwaarloosbaar op anesthesie35 en twee gemiddelden zijn vaak voldoende om te compenseren voor bewegings artefacten.
Toekomstige toepassingen of richtingen van de methode .
De bereiding kan worden gecombineerd met micro-endoscopen26,43. Micro-endoscopen zijn stijve optische sondes die gebruik maken van gradiënt brekingsindex (GRIN) micro lenzen om licht van en naar diep weefsel18te leiden. Het gebruik van micro-endoscopen maakt canules van kleinere diameters of zelfs geen canules helemaal. Commerciële micro-endoscopen zijn echter minder goed gecorrigeerd voor optische aberraties en hebben lagere NA dan commerciële doelstellingen. Stroom voelers bereiken laterale en axiale resoluties van ≈ 0,6-1 μm, ≈ 10-12 μm, respectievelijk17,18,44. Het gebruik van micro-endoscopen maakt ook de combinatie van dit preparaat mogelijk met Head-Mounted geïntegreerde Widefield microscopen45,46,47.
De methode leent zich ook om te gebruiken in niet-anesthetized muizen, en het is gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire activiteit met behulp van CA2 + sensoren in wakker hoofd-vaste muizen21,37,48,49. In deze gevallen, als gevolg van de snelle tijdschalen van de fluorescentie veranderingen, is het raadzaam om te implementeren lijn registratie50. Het is ook mogelijk om de voorbereiding voorbeeld vorming van andere subregio’s van hippocampal, zoals de getand gyrus (DG)39,51,52, aan te passen. Het combineren van dit preparaat met 3p excitatie53,54 met 1 MHz frequentie gepulseerde Laser afgestemd op 1400 nm, we konden dieper beeld in de hippocampal formatie bereiken van de moleculaire laag, submodule cellaag en de Hilus van het DG (Figuur 4) zonder het opheffen van de overplaatsing Ca1.
Concluderend, presenteren we een methode die optische toegang tot de dorsale Hippocampus biedt en toelaat longitudinale en correlatieve studies van de dynamiek van de hippocampal structuur en activiteit. Deze techniek breidt de mogelijkheden van de analyse van de hippocampal functie onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. wordt ondersteund door de Schram Foundation; C.-W. T. P. en W. G. worden ondersteund door de Max Planck Society; L.Y. en R.Y. worden ondersteund door de Max Planck Society en het National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. wordt ondersteund door een KP7-subsidie van de Europese Onderzoeksraad, de ERANET-en I-CORE-Programma’s, de Chief Scientist Office van het Israëlische ministerie van volksgezondheid, het federale ministerie van onderwijs en onderzoek, Roberto en Renata Ruhman, Bruno en Simone Lich, de Nella en Leon Benoziyo centrum voor neurologische aandoeningen, het Henry Chanoch Krenter Instituut voor biomedische beeldvorming en genomics, de Israel Science Foundation de Perlman familie, Adelis, Marc Besen, Pratt en Irving I. Moskowitz Foundations; A. A. wordt ondersteund door de Max Planck Society, de Schram Foundation en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). De 3P beelden werden verworven tijdens de Advanced cursus over neuroimaging technieken aan het Max Planck Florida Institute for Neuroscience. De geavanceerde cursus over neuroimaging-technieken wordt ondersteund door de Max Planck Society, het Florida State Max Planck Scientific Fellowship Program en het Max Planck Florida Institute Corporation Partnership Program. We willen Thorlabs, coherente en SpectraPhysics bedanken voor het leveren van ondersteuning en apparatuur voor het 2P/3P Imaging System tijdens de cursus. We zijn Henry Haeberle en Melissa Eberle ook dankbaar voor hulp bij het systeem tijdens de cursus.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |