التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي
Summary
بروتوكاتيتشواتي 3, 4-ديوكسيجيناسي (PCD) يمكن انزيمي أزاله الأكسجين ثنائي الذرة الحرة من نظام مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA). يصف هذا البروتوكول التعبير ، وتنقيه ، وتحليل النشاط لهذا الانزيم الكسح الأوكسجين.
Abstract
ويستخدم المجهر جزيء واحد (SM) في دراسة التفاعلات الجزيئية الديناميكية من فلوكوفيري المسمية الجزيئات الحيوية في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فان الفلوروبيورس عرضه لفقدان الاشاره عن طريق الرشح بواسطة الأكسجين المذاب (O2). لمنع الارتشاح الضوئي وأطاله عمر الفلوفيبيوم ، يتم استخدام أنظمه المسح بالأكسجين (OSS) لتقليل O2. وقد تكون البرمجيات المتاحة تجاريا ملوثه بالأحماض النووية التي تلحق ضررا أو تحللا ، وتفسر النتائج التجريبية تفسيرا محيرا. هنا نقوم بالتفصيل بروتوكول للتعبير وتنقيه الزائفة النشطة للغاية putida بروتوكاتيتشواتي-3 ، ديوكسيجيناسي (PCD) مع عدم وجود تلوث النواز قابل للكشف. يمكن PCD أزاله بكفاءة O2 الأنواع التفاعلية عن طريق تحويل الركيزة حمض بروتوكاتيتشويك (PCA) إلى 3-كربوكسي كومنولث الدول المستقلة ، وحمض كومنولث الدول المستقلة-muconic. ويمكن استخدام هذا الأسلوب في اي نظام مائي حيث O2 يلعب دورا ضارا في الحصول علي البيانات. هذا الأسلوب هو فعال في إنتاج النشطة للغاية ، النواز الحرة PCD بالمقارنة مع PCD المتاحة تجاريا.
Introduction
جزيء واحد (SM) الفيزياء الحيوية هو حقل ينمو بسرعة تغيير الطريقة التي ننظر فيها إلى الظواهر البيولوجية. هذا المجال لديه القدرة الفريدة لربط القوانين الاساسيه للفيزياء والكيمياء إلى علم الاحياء. المجهر الفلوري هو الطريقة البيوفيزيائية واحده التي يمكن ان تحقق حساسية SM. يستخدم الفلوري للكشف عن الجزيئات الحيوية عن طريق ربطها بالفلور العضوية الصغيرة أو النقاط الكمية1. هذه الجزيئات يمكن ان تنبعث منها الفوتونات عندما متحمس باشعه الليزر قبل التسرب الضوئي لا رجعه فيه2. يحدث الرشح الضوئي عندما تخضع الملصقات الفلورية للضرر الكيميائي الذي يدمر قدرتها علي الاثاره عند الموجه الموجية المطلوبة2،3. وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في العازلة المائية هي السبب الرئيسي لتسرب الصور2،4. بالاضافه إلى ذلك ، روس يمكن ان تتلف الجزيئات الحيوية ويؤدي إلى ملاحظات خاطئه في التجارب SM5،6. لمنع الضرر التاكسدي ، ويمكن استخدام أنظمه المسح الأوكسجين (OSS)3،7،8. نظام اكسيداز الجلوكوز/catalase (GODCAT) هو فعال في أزاله الأكسجين8، ولكنه ينتج الأكاسيد الفوقية الضارة المحتملة كوسيطه. قد تكون هذه الاضرار إلى الجزيئات الحيوية للاهتمام في دراسات SM.
بدلا من ذلك ، بروتوكاتيتشواتي 3, 4 ديوكسيجيناسي (PCD) سوف يزيل بكفاءة O2 من محلول مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA)7,9. PCD هو الانزيم الفلزي الذي يستخدم الحديد اللاهيمي لتنسيق PCA وتحفيز حلقه الكاتهول رد فعل الافتتاح باستخدام المذاب O210. ويظهر هذا التفاعل خطوه واحده ليكون أفضل OSS عموما لتحسين الاستقرار فلوكوفيري في تجارب SM7. لسوء الحظ ، تحتوي العديد من الانزيمات OSS المتاحة تجاريا ، بما في ذلك PCD ، تلوث النوكليميس11. ويمكن ان تؤدي هذه الملوثات إلى تلف الركائز المستندة إلى الأحماض النووية المستخدمة في تجارب SM. سيوضح هذا العمل بروتوكول تنقيه يستند إلى الفصل اللوني لاستخدام PCD المؤتلف في أنظمه SM. يمكن تطبيق PCD علي نطاق واسع علي اي تجربه حيث تتلف الركائز اللازمة للحصول علي البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعاده ما يتم تضمين أنظمه المسح الأوكسجين في جزيء واحد المجهر المجهري للحد من التصوير الضوئي3,7,8. وغالبا ما تستخدم هذه التقنيات المجهرية لمراقبه الأحماض النووية أو تفاعلات البروتين مع الأحماض النووية1،13?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة GM121284 و AI126742 إلى KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Riferimenti
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
