न्यूक्लीज-फ्री ऑक्सीजन स्कैवेंडर प्रोटोकैकेट 3,4-डिऑक्सिकाज़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि
Summary
प्रोटोकेटचुएट 3,4-डाइऑक्सिजन (पीसीडी) अपने सब्सट्रेट प्रोटोकाक्यूटिक एसिड (पीसीए) का उपयोग करके एक जलीय प्रणाली से मुक्त डाइएटॉमिक ऑक्सीजन को एंजाइमेट रूप से हटा सकता है। यह प्रोटोकॉल इस ऑक्सीजन मैला ढोने वाले एंजाइम की अभिव्यक्ति, शुद्धि और गतिविधि विश्लेषण का वर्णन करता है।
Abstract
वास्तविक समय में फ्लोरोफोर लेबल वाले बायोमॉलिक्यूल्स के गतिशील आणविक इंटरैक्शन के अध्ययन में एकल अणु (एसएम) माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। हालांकि, फ्लोरोफोरस को भंग ऑक्सीजन (ओ2)द्वारा फोटोब्लीचिंग के माध्यम से सिग्नल के नुकसान का खतरा होता है। फोटोब्लीचिंग को रोकने और फ्लोरोफोर जीवनकाल का विस्तार करने के लिए, ओ2को कम करने के लिए ऑक्सीजन सफाई प्रणाली (ओएसएस) कार्यरत हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ओएसएस न्यूक्लीज द्वारा दूषित हो सकता है जो न्यूक्लिक एसिड को नुकसान या नीचा दिखाता है, प्रायोगिक परिणामों की व्याख्या करता है। यहां हम कोई पता लगाने योग्य न्यूक्लीज संदूषण के साथ अत्यधिक सक्रिय स्यूडोमोनास पुटिडा प्रोटोकेटचुएट-3,4-डाइऑक्सिकाज़ (पीसीडी) की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। पीसीडी सब्सट्रेट प्रोटोकाटेचुइक एसिड (पीसीए) को 3-कार्बोक्सी-सिस, सिस-म्यूकोनिक एसिड में बदलने से प्रतिक्रियाशील ओ2 प्रजातियों को कुशलतापूर्वक हटा सकता है। इस विधि का उपयोग किसी भी जलीय प्रणाली में किया जा सकता है जहां ओ2 डेटा अधिग्रहण में हानिकारक भूमिका निभाता है। यह विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीडी की तुलना में अत्यधिक सक्रिय, न्यूलीज फ्री पीसीडी के उत्पादन में प्रभावी है।
Introduction
एकल अणु (एसएम) बायोफिजिक्स एक तेजी से बढ़ते क्षेत्र है जिस तरह से हम जैविक घटना को देखो बदल रहा है । इस क्षेत्र में भौतिकी और रसायन विज्ञान के मौलिक कानूनों को जीव विज्ञान से जोड़ने की अनूठी क्षमता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एक बायोफिजिकल मेथड है जो एसएम संवेदनशीलता को हासिल कर सकती है। फ्लोरेसेंस का उपयोग जैव अणुओं का पता लगाने के लिए छोटे कार्बनिक फ्लोरोफोरस या क्वांटम डॉट्स1से जोड़कर किया जाता है । ये अणु फोटोब्लीचिंग अपरिवर्तनीय रूप से2से पहले लेजर से उत्साहित होने पर फोटॉन उत्सर्जित कर सकते हैं । फोटोब्लीचिंग तब होती है जब फ्लोरोसेंट लेबल रासायनिक क्षति से गुजरते हैं जो वांछित तरंगदैर्ध्य2,3पर उत्तेजित करने की उनकी क्षमता को नष्ट कर देता है । जलीय बफर में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओस) की उपस्थिति फोटोब्लीचिंग2,4का प्राथमिक कारण है। इसके अतिरिक्त, आरओएस जैव अणुओं को नुकसान पहुंचा सकता है और एसएम प्रयोगों5,6 में गलत टिप्पणियोंकाकारण बन सकता है। ऑक्सीडेटिव क्षति को रोकने के लिए, ऑक्सीजन सफाई प्रणाली (OSS)काउपयोग3,7,8किया जा सकता है। ग्लूकोज ऑक्सीडेस/कैटालास (GODCAT) प्रणाली ऑक्सीजन8को हटाने में कुशल है, लेकिन यह मध्यवर्ती के रूप में संभावित हानिकारक पेरोक्साइड पैदा करता है । ये एसएम अध्ययनों में रुचि के जैव अणुओं के लिए हानिकारक हो सकते हैं।
वैकल्पिक रूप से, प्रोटोकेटचुएट 3,4 डाइऑक्सिजन (पीसीडी) अपने सब्सट्रेट प्रोटोकाक्यूटिक एसिड (पीसीए)7,9का उपयोग करके एक जलीय समाधान से ओ2 को कुशलतापूर्वक हटा देगा। पीसीडी एक मेटलोएंजाइम है जो पीसीए के समन्वय के लिए नोहेम आयरन का उपयोग करता है और भंग ओ210का उपयोग करके कैटेकोकल रिंग ओपनिंग रिएक्शन को उत्प्रेरक करता है। यह एक कदम प्रतिक्रिया एसएमप्रयोगों 7में फ्लोरोफोर स्थिरता में सुधार के लिए एक समग्र बेहतर OSS दिखाया गया है । दुर्भाग्य से, पीसीडी सहित कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ओएसएस एंजाइमों में11को दूषित किया जाता है। ये संदूषक एसएम प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले न्यूक्लिक एसिड-आधारित सब्सट्रेट्स को नुकसान पहुंचा सकते हैं। यह काम एसएम सिस्टम में रीकॉम्बिनेंट पीसीडी के उपयोग के लिए एक क्रोमेटोग्राफी आधारित शुद्धिकरण प्रोटोकॉल को स्पष्ट करेगा। पीसीडी मोटे तौर पर किसी भी प्रयोग पर लागू किया जा सकता है जहां आरओस डेटा अधिग्रहण के लिए आवश्यक सब्सट्रेट्स को नुकसान पहुंचा रहा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑक्सीजन स्कैलिंग सिस्टम आमतौर पर फोटोब्लीचिंग3,7,8को कम करने के लिए एकल अणु फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में शामिल होते हैं . इन माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग अक्सर न्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच जीएम 121284 और एआई 126742 ने सीके को सपोर्ट किया।
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Riferimenti
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
