Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi
Summary
Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) può rimuovere ezimaticamente l’ossigeno diatomico libero da un sistema acquoso utilizzando il suo acido protocatechuico del substrato (PCA). Questo protocollo descrive l’espressione, la purificazione e l’analisi dell’attività di questo enzima di scavenging dell’ossigeno.
Abstract
La microscopia a singola molecola (SM) viene utilizzata nello studio delle interazioni molecolari dinamiche delle biomolecole con etichetta fluoroforo in tempo reale. Tuttavia, i fluorofori sono inclini alla perdita di segnale tramite fotosbiancamento mediante ossigeno disciolto (O2). Per prevenire il fotosbiancamento ed estendere la durata del fluoroforo, vengono impiegati sistemi di scavenging dell’ossigeno (OSS) per ridurre O2. L’OSS commercialmente disponibile può essere contaminato da nucleasi che danneggiano o degradano gli acidi nucleici, confondendo l’interpretazione dei risultati sperimentali. Qui abbiamo dettagliato un protocollo per l’espressione e la purificazione di Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-diossigenasi (PCD) senza contaminazione da nuclease rilevabile. La PCD può rimuovere in modo efficiente le specie reattive di O2 mediante la conversione dell’acido protocatechuic del substrato (PCA) in 3 carboxy-cis, acido cis-muconico. Questo metodo può essere utilizzato in qualsiasi sistema acquoso in cui O2 svolge un ruolo dannoso nell’acquisizione dei dati. Questo metodo è efficace nella produzione di PCD altamente attivo e privo di nuclesi o meno rispetto al PCD disponibile in commercio.
Introduction
La biofisica a singola molecola (SM) è un campo in rapida crescita che cambia il modo in cui guardiamo ai fenomeni biologici. Questo campo ha la capacità unica di collegare le leggi fondamentali della fisica e della chimica alla biologia. La microscopia a fluorescenza è un metodo biofisico che può raggiungere la sensibilità SM. La fluorescenza viene utilizzata per rilevare le biomolecole collegandole a piccoli fluorofori organici o punti quantici1. Queste molecole possono emettere fotoni quando sono eccitate dai laser prima del fotosbiancamento irreversibilmente2. Il fotosbiancamento si verifica quando le etichette fluorescenti subiscono danni chimici che distruggono la loro capacità di eccitare alla lunghezza d’onda desiderata2,3. La presenza di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in tamponanti acquosi sono una causa primaria di fotosbiancamento2,4. Inoltre, ROS può danneggiare le biomolecole e portare a osservazioni errate negli esperimenti SM5,6. Per prevenire danni ossidativi, i sistemi di scavenging dell’ossigeno (OSS) possono essere utilizzati3,7,8. Il sistema di ossidasi/catalasi di glucosio (GODCAT) è efficiente nella rimozione dell’ossigeno8, ma produce come intermedi. Questi possono essere dannosi per le biomolecole di interesse negli studi SM.
In alternativa, protocatechuate 3,4 diossigenasi (PCD) rimuoverà in modo efficiente O2 da una soluzione acquosa utilizzando il suo acido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD è un metalloenze che utilizza ferro nonheme per coordinare PCA e catalizzare la reazione di apertura dell’anello catechol utilizzando disciolto O210. Questa reazione in un solo passo è indicata per essere un OSS nel complesso migliore per migliorare la stabilità del fluoroforo negli esperimenti SM7. Sfortunatamente, molti enzimi OSS disponibili in commercio, tra cui PCD, contengono nucleasi contaminati11. Questi contaminanti possono portare al danno dei substrati a base di acido nucleico utilizzati negli esperimenti SM. Questo lavoro chiarirà un protocollo di purificazione basato sulla cromatografia per l’uso di PCD ricombinanti nei sistemi SM. La PCD può essere ampiamente applicata a qualsiasi esperimento in cui i ROS danneggiano i substrati necessari per l’acquisizione dei dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
I sistemi di scavenging dell’ossigeno sono comunemente inclusi nella microscopia a fluorescenza a singola molecola per ridurre il fotosbiancamento3,7,8. Queste tecniche di microscopia sono spesso utilizzate per osservare gli acidi nucleici o le interazioni proteiche con gli acidinucleici1,13,14. La contaminazione di OSS con nucleasi pu?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH GM121284 e AI126742 a KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Riferimenti
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