Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase
Summary
Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisk fjerne fritt diatomic oksygen fra et vandig system ved hjelp av sitt substrat protocatechuic syre (PCA). Denne protokollen beskriver uttrykket, rensing, og aktivitet analyse av dette oksygen rensing enzymet.
Abstract
Enkelt molekyl (SM) mikroskopi brukes i studiet av dynamiske molekylære interaksjoner av fluoroforen merket biomolekyler i sanntid. Men fluorophores er utsatt for tap av signal via photobleaching av oppløst oksygen (O2). For å hindre photobleaching og forlenge fluoroforen levetid, er oksygen rensing systemer (OSS) ansatt for å redusere O2. Kommersielt tilgjengelige operativsystemer kan være forurenset av nukleaser som skader eller forringe nukleinsyre syrer, forvirrende tolkning av eksperimentelle resultater. Her detalj vi en protokoll for uttrykk og rensing av svært aktive Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-DIOXYGENASE (PCD) uten synlig nuklease forurensning. PCD kan effektivt fjerne reaktiv O2 arter ved konvertering av underlaget protocatechuic acid (PCA) til 3-carboxy-CIS, CIS-muconic acid. Denne metoden kan brukes i alle vandige systemer der O2 spiller en ødeleggende rolle i datainnhenting. Denne metoden er effektiv i å produsere svært aktiv, nuklease gratis PCD i sammenligning med kommersielt tilgjengelige PCD.
Introduction
Enkelt molekyl (SM) biofysikk er et raskt voksende felt endre måten vi ser på biologiske fenomener. Dette feltet har den unike evnen til å knytte grunnleggende lover i fysikk og kjemi til biologi. Fluorescens mikroskopi er en Biofysiske metode som kan oppnå SM følsomhet. Fluorescens brukes til å oppdage biomolekyler ved å koble dem til små organiske fluorophores eller kvante prikker1. Disse molekylene kan avgi fotoner når de er opphisset av lasere før photobleaching irreversibelt2. Photobleaching oppstår når fluorescerende etiketter gjennomgår kjemiske skader som ødelegger deres evne til å opphisse på ønsket bølgelengde2,3. Tilstedeværelsen av reaktive oksygen arter (ros) i vandig buffer er en primær årsak til photobleaching2,4. I tillegg kan ros skade biomolekyler og føre til feilaktige observasjoner i SM eksperimenter5,6. For å forebygge oksidativt skade, kan oksygen rensing systemer (oss) brukes3,7,8. Glukose oksidase/catalase (GODCAT) systemet er effektiv på å fjerne oksygen8, men det gir potensielt skadelige peroksider som mellom produkter. Dette kan være skadelig for biomolekyler av interesse i SM studier.
Alternativt vil protocatechuate dioxygenase (PCD) effektivt fjerne O2 fra en vandig oppløsning ved hjelp av dens substrat protocatechuic acid (PCA)7,9. PCD er en metalloenzyme som bruker negemovoj jern for å koordinere PCA og katalysere catechol ring åpnings reaksjonen ved hjelp av oppløst O210. Dette ett trinn reaksjon er vist å være en helhetlig bedre OSS for å forbedre fluoroforen stabilitet i SM eksperimenter7. Dessverre, mange kommersielt tilgjengelige OSS-enzymer, inkludert PCD, inneholder forurensende nukleaser11. Disse forurensninger kan føre til skade av nukleinsyre syre-baserte underlag som brukes i SM eksperimenter. Dette arbeidet vil belyse en kromatografi-basert rensing protokoll for bruk av rekombinant PCD i SM systemer. PCD kan grovt brukes på alle eksperiment der ROS er skadelige underlag som trengs for datainnsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oksygen rensing systemer er vanligvis inkludert i enkelt molekyl fluorescens mikroskopi å redusere photobleaching3,7,8. Disse mikroskopi teknikkene brukes ofte til å observere nukleinsyre syrer eller protein interaksjoner med nukleinsyre syrer1,13,14. Forurensning av OSSs med nukleaser kan føre til falske resultater.
<p class="jo…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH GM121284 og AI126742 til KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Riferimenti
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
