Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma
Summary
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) enzimatik substrat protokatechuic asit kullanarak sulu bir sistemden serbest diatomik oksijen kaldırabilirsiniz (PCA). Bu protokol, bu oksijen atma enziminin ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivite analizini açıklar.
Abstract
Tek moleküllü (SM) mikroskopi florofor etiketli biyomoleküllerin dinamik moleküler etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesinde kullanılır. Ancak, floroforlar çözünmüş oksijen (O2)ile fotobeyazrlama yoluyla sinyal kaybına yatkındır. Fotobeyaztma önlemek ve florofor ömrünü uzatmak için, oksijen atma sistemleri (OSS) O2azaltmak için istihdam edilmektedir. Ticari olarak kullanılabilen OSS, nükleik asitlere zarar veren veya bozan nükleazlar tarafından kontamine olabilir, deneysel sonuçların şaşırtıcı yorumu. Burada, saptanabilir nükleaz kontaminasyonu olmayan son derece aktif Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioksijenaz (PCD) ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol ayrıntılı. PCD verimli substrat protocatechuic asit dönüşüm tarafından reaktif O2 türler kaldırabilirsiniz (PCA) 3-karboksi-cis, cis-muconic asit. Bu yöntem, O2’nin veri toplamada zararlı bir rol oynadığı herhangi bir sulu sistemde kullanılabilir. Bu yöntem, ticari olarak mevcut PCD ile karşılaştırıldığında son derece aktif, çekirdeksiz PCD üretiminde etkilidir.
Introduction
Tek moleküllü (SM) biyofizik, biyolojik fenomenlere bakış ını değiştiren hızla büyüyen bir alandır. Bu alan, fiziğin ve kimyanın temel kanunlarını biyolojiye bağlama yeteneğine sahiptir. Floresan mikroskopi SM duyarlılığı elde edebilirsiniz bir biyofiziksel yöntemdir. Floresan küçük organik floropores veya kuantum nokta 1 onları bağlayarak biyomolekülleri tespit etmek içinkullanılır. Bu moleküller geri dönüşümsüz2fotobeyazlatma önce lazerler tarafından heyecanlı fotonlar yontabilir. Fotobeyazrlama floresan etiketler istenilen dalga boyu2,3de heyecanlandırmak için yeteneklerini yok kimyasal hasar geçmesi oluşur. Sulu tampon reaktif oksijen türlerinin varlığı (ROS) fotobeyazrlama birincilnedeni 2,4. Ayrıca, ROS biyomoleküllere zarar verebilir ve SM deneylerinde hatalı gözlemlere yol açabilir5,6. Oksidatif hasarı önlemek için oksijen atma sistemleri (OSS)3,7,8kullanılabilir. Glikoz oksidaz/ katalaz (GODCAT) sistemi oksijen kaldırma da etkilidir8, ama ara olarak potansiyel olarak zararlı peroksitler üretir. Bunlar SM çalışmalarında ilgi biyomoleküllere zarar verebilir.
Alternatif olarak, protocatechuate 3,4 dioksijenaz (PCD) verimli bir substrat protocatechuic asit kullanarak sulu bir çözelti O2 kaldıracak (PCA)7,9. PCD, PCA’yı koordine etmek ve çözünmüş O210kullanarak kateşol halka açma reaksiyonunu katalize etmek için hemesiz demir kullanan bir metalloenzimdir. Bu bir adım reaksiyonS deneyleri florofor stabilitesini artırmak için genel olarak daha iyi bir OSS olduğu gösterilmiştir7. Ne yazık ki, PCD de dahil olmak üzere birçok ticari OSS enzimleri, kontamine nükleaz lar içerir11. Bu kirleticiler, SM deneylerinde kullanılan nükleik asit bazlı yüzeylerin zarar görmesine yol açabilir. Bu çalışma, SM sistemlerinde rekombinant PCD kullanımı için kromatografi tabanlı bir arıtma protokolü açıklayacaktır. PCD, ROS’un veri toplama için gereken yüzeylere zarar kaynağı olduğu tüm denemelere genel olarak uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oksijen atma sistemleri genellikle tek moleküllü floresan mikroskobu nda fotobeyaztma azaltmak için3,7,8dahildir. Bu mikroskopteknikleri genellikle nükleik asitler veya nükleik asitler 1 ,13,14ile protein etkileşimleri gözlemlemek için kullanılır. OSS’lerin nükleazlarla kirlenmesi sahte sonuçlara yol açabilir.
<p class=…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH GM121284 ve AI126742 tarafından KEY’e desteklenmiştir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Riferimenti
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
