Изоляция миоэпителиальных клеток от взрослых Мурина Лакрималила и Субмандибулярных желез
Summary
Лакримальная железа (LG) имеет два типа клеток, выражающих атоин(ЗСМА) ( и миоэпителиальные клетки (МЭК) и перициты. MECs имеют эктодермального происхождения, найденные во многих железистых тканях, в то время как перициты являются сосудистыми гладкими мышечными клетками эндодермального происхождения. Этот протокол изолирует МЭЦ и перициты из мурин-ЛГ.
Abstract
Lacrimal железа (LG) является экзокриной трубоацинара железы, которая выделяет aqueous слой слезной пленки. Эпителиальное дерево LG состоит из ацинара, протоковых эпителиальных и миоэпителиальных клеток (МЭК). MECs выражают альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА) и имеют сократительный функцию. Они находятся в нескольких железистых органов и имеют эктодермального происхождения. Кроме того, LG содержит SMA’ сосудистые гладкие мышечные клетки эндодермального происхождения, называемые перицитами- сократительные клетки, которые окутывает поверхность сосудистых труб. Новый протокол позволяет нам изолировать как МЭЦ, так и перициты от взрослых мурин-ЛГ и субмандибулярных желез (СМГ). Протокол основан на генетической маркировке MECs и перицитов с использованием SMACreErt2 /“”Rosa26-TdTomatofl/fl мышь штамма, а затем подготовка LG одноклеточной подвески для флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS ). Протокол допускает разделение этих двух клеточных популяций разного происхождения на основе выражения молекулы эпителиальной клеточной адгезии (EpCAM) мЕК, в то время как перициты не выражают EpCAM. Изолированные клетки могут быть использованы для культивирования клеток или анализа экспрессии генов.
Introduction
Миоэпителиальные клетки (MECs) присутствуют во многих экзокринных желез, включая lacrimal, слюнные, жесткие, пот, простата, и молочные. MECs являются уникальным типом клеток, который сочетает в себе эпителиальный и гладкий мышечный фенотип. MECs выражают а-гладкий мышечный актин (SMA) и имеют сократительной функции1,2. В дополнение к MECs, lacrimal gland (LG) и submandibular железа (SMG) содержит sMA’ сосудистые клетки, называемые перицитами, которые являются клетками эндодермального происхождения, которые окутывают поверхность сосудистых труб3. Хотя MECs и перициты выражают много маркеров, SMA является единственным маркером, который не выражается в других lg и SMG ячейки1,3.
В течение последних 40 лет несколько лабораторий сообщали о проведении анализов на диссоциацию различных тканей экзокринной железы, в которых применялись неэнзиматические и ферментативные подходы. В одном из первых докладов, опубликованных в 1980 году, Фриц и соавторы описали протокол для изоляции кошачьих околоунид ацини с использованием последовательного пищеварения в коллагеназе / трипсин решение4. В 1989 году Ханн и соавторы скорректировали этот протокол для изоляции ацини от крыс LGs с помощью смеси коллагеназы, гиалуронидаза и DNase5. В 1990 году Криппс и его коллеги опубликовали метод неферментатической диссоциации лакримальной железы acini6. Позже, в 1998 году, Зухри и его соавторы вернулись к ферментативному протоколу диссоциации для последующей ca2“-изображения на LG и SMG изолированных ацини7. В течение последнего десятилетия исследователи сосредоточили свое внимание на изоляции стволовых/прародителей клеток от экзокринных желез. Pringle и соавторы описали протокол в 2011 для изоляции стволовых клеток мыши SMG8. Этот метод был основан на изоляции стволовых клеток, содержащих салисферы, которые были сохранены в культуре. Авторы утверждали, что размножающиеся клетки, выражающие стволовые клетки связанных маркеров могут быть изолированы от этих салисфер8. Шатос и соавторы опубликовали протокол для изоляции клеток-прародителей от невредимых взрослых крыс LGs с использованием ферментативного пищеварения и сбора “освобожденных” клеток9. Позже, в 2015 году, Акерманн и его соавторы скорректировали эту процедуру, чтобы изолировать предполагаемые «мурин-лакримальные стволовые клетки» («mLGSCs»), которые могут распространяться как монослойная культура в течение нескольких проходов10. Однако ни одна из ранее упомянутых процедур не позволяла различать клеточные подтипы и отдельные популяции изолированных эпителиальных клеток. В 2016 году Громова и его соавторы опубликовали процедуру изоляции клеток LG стволовых/прародителей от взрослых мурин-лгусов с использованием FACS11. Однако этот протокол не был предназначен для изоляции МЭЦ.
Недавно мы показали, что мы можем изолировать клетки СМАЗ от 3 недельных sMA-GFP мышей12. Тем не менее, в это время мы не отделили различные популяции клеток СМАЗ. Здесь мы установили новую процедуру прямой изоляции дифференцированных МЭЦ и перицитов от взрослых ЛГ и СМГ.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи описан протокол MEC и перицитная изоляция от LG и SMG. Эта процедура была основана на генетической маркировке SMA, единственного надежного биомаркера МЭК и перицитов.
Актуальность разработки этого протокола была обусловлена почти полным отсутствием литератур…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Иво Калайжича за предоставление нам штамма мыши SMACreErt2, Такеши Умазуме для хвостохранилища и генотипирования, Марка Шелли за приобретение профессиональных фотографий для рисунка 2. Мы также благодарим Совет научных редакторов Скриппса и Марка Шелли за редактирование научного английского языка. Мы благодарны научно-исследовательскому институту Scripps Flow Cytometry core за помощь в сортировке клеток и доктору Робину Уилленбрилу за многочисленные обсуждения/консультации по анализу данных FACS.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом глаз гранты 5 R01 EY026202 и 1 R01 EY028983 до H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
Riferimenti
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochimica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
