Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.
Abstract
La cicatrización de heridas cutáneas deterioradas es una preocupación importante para los pacientes que sufren de diabetes y para las personas mayores, y es necesario un tratamiento eficaz. Los enfoques in vitro e in vivo adecuados son esenciales para la identificación de nuevas moléculas diana para tratamientos farmacológicos para mejorar el proceso de cicatrización de heridas en la piel. Identificamos la subunidad 3 de canales de calcio cerrados por voltaje (Cav-3) como una molécula objetivo potencial para influir en la cicatrización de heridas en dos ensayos independientes, es decir, el ensayo de migración de arañazos in vitro y el modelo de cámara de plegado de piel dorsal in vivo. Fibroblastos embrionarios de ratón primario (MEF) agudamente aislados de ratones de tipo salvaje (WT) y de cav3-deficienciat(Cav3KO) o fibroblastos agudamente aislados de ratones WT tratados con siRNA para regular la reducción de la expresión del gen Cacnb3 , se utilizaron la codificación Cav3. Se aplicó un rasguño en una monocapa de células confluentes y el cierre de brecha fue seguido por la toma de imágenes microscópicas en puntos de tiempo definidos hasta la repoblación completa de la brecha por las células migratorias. Estas imágenes se analizaron y se determinó la tasa de migración de celdas para cada condición. En un ensayo in vivo, implantamos una cámara dorsal en ratones WT y Cav-3 KO, aplicamos una herida circular definida de 2 mm de diámetro, cubrimos la herida con un cubrecristalo para protegerla de infecciones y desecación, y monitoreamos el cierre de la herida macroscópica con el tiempo. El cierre de heridas fue significativamente más rápido en cacnb3-ratones con deficiencia de genes. Debido a que los resultados de los ensayos in vivo y in vitro se correlacionan bien, el ensayo in vitro puede ser útil para el cribado de alto rendimiento antes de validar los golpes in vitro por el modelo de cicatrización de heridas in vivo. Lo que hemos mostrado aquí para ratones o células de tipo salvaje y de deficiencia deCav3 también podría ser aplicable para moléculas específicas distintas de Cav-3.
Introduction
La cicatrización de heridas en la piel comienza inmediatamente después de la lesión de la piel con el fin de restaurar la integridad de la piel y proteger al organismo de las infecciones. El proceso de cicatrización de heridas pasa por cuatro fases superpuestas; coagulación, inflamación, formación de tejido nuevo y remodelación tisular1. La migración celular es crucial durante estas fases. Las células inflamatorias, las células inmunitarias, los queratinocitos, las células endoteliales y los fibroblastos se activan en diferentes momentos e invaden el área de la herida2. Los métodos para investigar la cicatrización de heridas in vitro e in vivo son de gran interés no sólo para entender los mecanismos subyacentes, sino también para probar nuevos fármacos y desarrollar nuevas estrategias con el objetivo de mejorar y acelerar la cicatrización de heridas en la piel.
Para supervisar y analizar la migración de celdas, se puede utilizar el ensayo de migración de cero. A menudo se conoce como ensayo de cicatrización de heridas in vitro. Este método requiere una instalación de cultivo celular3. Es un procedimiento simple, no hay necesidad de equipos de alta gama y el ensayo se puede realizar en la mayoría de los laboratorios de biología celular. En este ensayo, una zona libre de células es creada por la interrupción mecánica de una monocapa celular confluente, preferiblemente células epiteliales o endoteliales o fibroblastos. Las celdas en el borde del rasguño se migrarán para volver a rellenar la brecha creada. La cuantificación del área libre de celdas decreciente con el tiempo se asemeja a la tasa de migración e indica el tiempo, que las celdas necesitan para cerrar la brecha. Para este propósito, los investigadores pueden utilizar células agudamente aisladas de ratones WT o ratones que carecen de un gen de interés4,o células inmortalizadas disponibles en repositorios celulares confiables. El ensayo de arañazos permite estudiar la influencia de los compuestos farmacológicamente activos o el efecto de los CDNA transinfectados o siRNAs en la migración celular.
In vivo, la cicatrización de heridas es un proceso fisiológico complejo, que requiere diferentes tipos de células, incluyendo queratinocitos, células inflamatorias, fibroblastos, células inmunitarias y células endoteliales con el fin de restaurar la integridad física de la piel lo más rápido posible1 . Diferentes métodos para estudiar la cicatrización de heridas in vivo se han desarrollado y utilizado en los últimos5,6,7,8. La cámara dorsal de pliegue de la piel descrita en este artículo se utilizó anteriormente para los ensayos de cicatrización de heridas9. Se utiliza como una preparación de la cámara dorsal de la piel modificada para ratones. El modelo de cámara skinfold modificado tiene varias ventajas. 1) Minimiza la contracción de la piel, lo que evita observar el proceso de cicatrización de heridas y podría influir en la reparación de heridas en ratones. 2) Esta cámara hace uso de cubrir la herida con un cubreobjetos de vidrio, reducir las infecciones de tejido y la desecación, que podría retrasar el proceso de curación. 3) El flujo sanguíneo y la vascularización se pueden controlar directamente. 4) Permite la aplicación tópica repetitiva de compuestos y reactivos farmacológicamente activos con el fin de tratar la herida y acelerar la curación9,10.
Identificamos la subunidad 3 de canales de calcio cerrados de alta tensión (Cav-3) como una molécula objetivo potencial para influir en la cicatrización de heridas de la piel utilizando dos protocolos independientes, es decir, el ensayo de migración de arañazos in vitro y el modelo de cámara de plegado de piel dorsal in vivo. Para el ensayo in vitro, utilizamos fibroblastos primarios, estas células expresan el gen Cacnb3 que codifica la proteína Cav-3, pero carecen de influjo Ca2+ inducido por despolarización o corrientes Ca2+ dependientes del voltaje. Hemos descrito una función novedosa de Cav-3 en estos fibroblastos: Cav-3 se une al receptor de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3R) y restricciones liberación de calcio del retículo endoplasmático. La eliminación del gen Cacnb3 en ratones conduce a una mayor sensibilidad del IP3R para IP3, una mayor migración celular y una mayor reparación de heridas cutáneas4.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, describimos un ensayo de cicatrización de heridas in vitro e in vivo y correlacionamos los resultados obtenidos. Para el ensayo in vitro, utilizamos fibroblastos primarios de ratón4,14,15 que juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y la remodelación detejidos 11. También se pueden utilizar otros tipos de células adherentes que crecen como monocapas (por ejemplo,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Petra Weissgerber y a la Unidad Transgénica de la instalación animal SPF (proyecto P2 de la SFB 894) de la Facultad de Medicina y a la instalación animal del Instituto de Cirugía Clínica y Experimental de la Facultad de Medicina de la Universidad del Sarre, Homburg. Agradecemos al Dr. Andreas Beck por la lectura crítica del manuscrito. Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, proyecto A3 a A.B. y V.F.).
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
Riferimenti
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