Studere Cryptosporidium infeksjon i 3D tissue-avledet Human Organoid kultur systemer ved Microinjection
Summary
Vi beskriver protokoller for å forberede oocyster og rense sporozoitter for å studere smitte av menneskelige intestinal og luftveier organoids av Cryptosporidium parvum. Vi viser prosedyrene for microinjection av parasitter i intestinal organoid lumen og immunostaining av organoids. Til slutt beskriver vi isolering av genererte oocyster fra organoids.
Abstract
Cryptosporidium parvum er en av de viktigste årsakene til menneskelig diaré sykdom. For å forstå patologi av parasitten og utvikle effektive legemidler, en in vitro kultur system som viser forholdene i verten er nødvendig. Organoids, som ligner vevet i deres opprinnelse, er ideelle for å studere Host-parasitt interaksjoner. Organoids er tredimensjonale (3D) vev-avledet strukturer som er avledet fra voksne stamceller og vokse i kultur i lengre perioder uten gjennomgår noen genetisk aberrasjon eller transformasjon. De har godt definert polaritet med både apikale og basolateral overflater. Organoids har ulike anvendelser i narkotika testing, bio Banking, og sykdoms modellering og Host-mikrobe interaksjonsstudier. Her presenterer vi en steg-for-steg protokoll for hvordan å forberede oocyster og sporozoitter av Cryptosporidium for infeksjon Human intestinal og luftveiene organoids. Deretter viser vi hvordan microinjection kan brukes til å injisere mikrober i organoid lumen. Det er tre store metoder som organoids kan brukes til mikrobe interaksjonsstudier-microinjection, mekanisk klipping og plating, og ved å gjøre monolagere. Microinjection muliggjør vedlikehold av 3D-strukturen og muliggjør presis kontroll av parasitt volumer og direkte apikale side kontakt for mikrober. Vi gir detaljer for optimal vekst av organoids for enten avbildning eller oocyst produksjon. Til slutt viser vi også hvordan de nylig genererte oocyster kan isoleres fra organoid for videre nedstrøms prosessering og analyse.
Introduction
Utvikling av medikamenter eller vaksiner for behandling og forebygging av Cryptosporidium -smitte har blitt hindret av mangelen på in vitro-systemer som nettopp etterligner in vivo-situasjonen hos mennesker1,2. Mange av de tilgjengelige systemer enten bare tillate kortvarig infeksjon (< 5 dager) eller ikke støtter den komplette livssyklusen av parasitten3,4. Andre systemer som muliggjør fullstendig utvikling av parasitten er basert på udødeliggjort cellelinjer eller kreftcelle linjer som ikke trofast recapitulate den fysiologiske situasjonen hos mennesker5,6,7 . Organoids eller “mini-organer” er 3D vev avledet strukturer som dyrkes i en ekstracellulære matrise supplert med ulike vev spesifikke vekstfaktorer. Organoids har blitt utviklet fra ulike organer og vev. De er genetisk stabile og recapitulate de fleste funksjoner av organene av deres opprinnelse, og kan opprettholdes i kultur i lengre perioder av gangen. Vi har utviklet en metode for å infisere menneskelige intestinal og lunge organoids med Cryptosporidium som gir en nøyaktig in vitro modell for studiet av Host-parasitt interaksjoner relevant for intestinal og respiratoriske cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. I motsetning til andre publiserte kultur modeller, organoid systemet er representativt for virkelige liv vert parasitt interaksjoner, gir mulighet for fullføring av livssyklusen slik at alle stadier av parasitten livssyklus kan bli studert, og opprettholder parasitten forplantning i opptil 28 dager10.
Cryptosporidium parvum er en apicomplexan parasitt som infiserer epitel i luftveiene og tarm trakter, forårsaker langvarig diaré sykdom. Den resistente miljø scenen er oocyst, funnet i forurenset mat og vann14. Når svelget eller inhalert, oocyst excysts og utgivelser fire sporozoitter som fester til epitelceller. Sporozoitter glir på vertene celler og engasjere vert celle reseptorer, men parasitten ikke fullt ut invadere cellen, og ser ut til å indusere verten cellen til sluker det15. Parasitten, som er internalisert innenfor en intracellulære men extracytoplasmic kupé, forblir på den apikale overflaten av cellen, replikere i en parasitophorous vacuole. Den gjennomgår to runder med aseksuell reproduksjon – en prosess som kalles merogony. I løpet av merogony, type jeg meronts utvikle hvilke inneholde åtte merozoitter det er befridd å invadere ny celler. Disse merozoitter invadere nye celler for å utvikle seg til type II meronts inneholder fire merozoitter. Disse merozoitter, når den slippes, infisere celler og utvikle seg til macrogamonts og microgamonts. Microgametes utgis og gjødsle macrogametes som produserer zygotes som modnes til oocyster. Eldre oocyster blir senere sluppet inn i lumen. Oocyster er enten tynne vegger som umiddelbart excyst å reinfect epitel, eller tykke vegger som slippes ut i miljøet for å infisere den neste verten14. Alle stadier av Cryptosporidium livssyklus har blitt identifisert i det organoid kultur systemet som tidligere er utviklet av vår gruppe10.
Siden menneskelige organoids trofast gjenskape menneskelige vev9,11,13, og støtter alle replicative stadier av Cryptosporidium10, de er den ideelle vev kultur system for å studere Cryptosporidium biologi og Host-parasitt interaksjoner. Her beskriver vi prosedyrene for å infisere organoids med både Cryptosporidium oocyster og excysted sporozoitter, og isolere den nye oocyster produsert i dette vevet kultur system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kultur Cryptosporidium parasitter i tarm og luftveier organoids gir en nøyaktig modell for å studere Host-parasitt interaksjoner10 , men har også mange andre programmer. For eksempel, nåværende metoder for å velge og overføre genmodifiserte Cryptosporidium parasitter krever passasje i mus19 som ikke tillater isolering av parasitter som har modifikasjoner viktig for in vivo infeksjon. Organoid kulturen i Cryptosporidium gir et alternativ til…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for Deborah A. Schaefer fra School of Animal og komparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA for å hjelpe oss med oocyst produksjon og analyse. Vi takker også Franceschi mikroskopi og Imaging Center og D.L. Mullendore ved Washington State University for TEM forberedelse og Imaging av isolerte organoid oocyster.
D.D. er mottaker av en VENI stipend fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. er mottaker av en VENI stipend fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO-ALW, 863.14.002) og ble støttet av Marie Curie stipend fra EU-kommisjonen (forslag 330571 FP7-folk-2012-IIF). Forskningen som fører til disse resultatene har fått støtte fra det europeiske Forskningsrådet under ERC Advanced Grant Agreement no. 67013 og fra NIH NIAIH under R21 AT009174 til RMO. Dette arbeidet er en del av Oncode Institute, som er delvis finansiert av den nederlandske Cancer Society og ble finansiert av et stipend fra den nederlandske Cancer Society.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
Riferimenti
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
