Descriviamo protocolli per preparare le oocisti e purificare gli sporozoiti per studiare l'infezione degli organoidi intestinali e delle vie aeree da Cryptosporidium parvum. Dimostriamo le procedure per la microiniezione di parassiti nel lume organoide intestinale e l'immunostaining degli organoidi. Infine, descriviamo l'isolamento delle oocisti generate dagli organoidi.
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Articolo metodologico
Studio dell'infezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cryptosporidium parvum è una delle principali cause della malattia della diarrea umana. Per comprendere la patologia del parassita e sviluppare farmaci efficienti, è necessario un sistema di coltura in vitro che riassume le condizioni nell'ospite. Gli organiidi, che assomigliano molto ai tessuti della loro origine, sono ideali per studiare le interazioni ospite-parassita. Gli organiidi sono strutture derivate da tessuti tridimensionali (3D) che derivano da cellule staminali adulte e crescono in coltura per lunghi periodi di tempo senza subire alcuna aberrazione genetica o trasformazione. Hanno una polarità ben definita con superfici apicali e basolaterali. Gli organiidi hanno varie applicazioni nei test farmacologici, nel bio banking e nella modellazione della malattia e negli studi sull'interazione tra host e microbo. Qui presentiamo un protocollo passo-passo di come preparare le oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium per infettare gli organoidi intestinali e delle vie aeree umane. Dimostriamo quindi come la microiniezione può essere utilizzata per iniettare i microbi nel lume organoide. Ci sono tre metodi principali con cui gli organoidi possono essere utilizzati per gli studi di interazione host-microbe: microiniezione, tosatura meccanica e placcatura, e facendo monostrati. La microiniezione consente il mantenimento della struttura 3D e consente un controllo preciso dei volumi di parassiti e il contatto laterale apicale diretto per i microbi. Forniamo dettagli per una crescita ottimale degli organoidi per la produzione di imaging o oocisti. Infine, dimostriamo anche come le oocisti appena generate possono essere isolate dall'organoid per un'ulteriore elaborazione e analisi a valle.
Introduzione
Lo sviluppo di farmaci o vaccini per il trattamento e la prevenzione dell'infezione da Cryptosporidium è stato ostacolato dalla mancanza di sistemi in vitro che imitano precisamente la situazione in vivonell'uomo 1,2. Molti dei sistemi attualmente disponibili consentono solo l'infezione a breve termine (<5 giorni) o non supportano l'intero ciclo di vita del parassita3,4. Altri sistemi che consentono il completo sviluppo del parassita si basano su linee cellulari immortalate o linee cellulari tumorali che non ricapitolano fedelmente la situazio....
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Protocollo
Tutta la manipolazione e la resezione dei tessuti è stata eseguita in base ai protocolli approvati dall'IRB (Institutional Review Board) con il consenso del paziente.
1. Preparazione di C. parvum Oocysts per l'iniezione
NOT: Cryptosporidium oocisti sono stati acquistati da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali). Queste oocisti sono prodotte in vitelli e sono conservate in salina tampone di fosfato (PBS) con antibiotici. Possono essere conservati per circa 3 mesi a 4 gradi centigradi e non devono mai essere congelati. Normalmente usiamo le oocisti ent....
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Risultati
I protocolli qui presentati si traducono in un'efficiente purificazione di oocisti e sporozoiti (Figura 1A) pronti per la microiniezione. Il protocollo di esostation si traduce nel rilascio di sporozoiti da circa il 70-80% delle oocisti, quindi è essenziale filtrare le rimanenti oocisti e gusci attraverso un filtro da 3 m. Filtrazione risultati in quasi 100% sporozoite purificazione (Figura 1B). Inoltre, l'aggiunta di un coloranti verde aiuta a garantire l'iniez.......
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Discussione
La coltura dei parassiti del Cryptosporidium negli organoidi intestinali e delle vie aeree fornisce un modello accurato per studiare le interazioni ospite-parassita10, ma ha anche molte altre applicazioni. Ad esempio, gli attuali metodi di selezione e propagazione dei parassiti del Cryptosporidium geneticamente modificati richiedono un passaggio nei topi19, il che non consente l'isolamento dei parassiti che hanno modifiche essenziali per l'infezione in viv.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Deborah A. Schaefer della School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, Università dell'Arizona, Tucson, Az, USA per averci aiutato con la produzione e l'analisi degli oocisti. Ringraziamo anche Franceschi Microscopy and Imaging Center e D.L. Mullendore alla Washington State University per la preparazione e l'imaging di oocisti organoidi isolati.
D.D. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Estratto di membrana basale (matrice extracellulare) | amsbio | 3533-010-02 | Anticorpo |
| Crypt-a-Glo (anticorpo specifico per oocisti) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Concentrazione finale = Utilizzare 2-3 gocce/diapositiva |
| Crypto-Grab IgM rivestito Perline magnetiche | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Portapacchi Dynamag 15 | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rastrelliera | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Filtri a membrana in policarbonato Isopore - 3µ m | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Colorante verde veloce | SIGMA | F7252-5G | |
| Microiniettore Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000013 | |
| Capillari in vetro da 1 mm di diametro | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (matrice extracellulare) | Corning | 356237 | |
| Provetta per microfuga 1,5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Punte per microcaricatori | Eppendorf | 612-7933 | |
| Estrattore per micropipette P-97 | Strumento otturatore | P-97 | |
| Siero d'asino normale | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Ipoclorito di sodio (utilizzare il 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super bastone scivoli | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Portafiltro in policarbonato | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Acido tautocolico sale sodico idrato | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Agente di montaggio Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Quantità finale | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL di stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax Gibco | 35050038 | 5 mL di stock in 500 mL | |
| DMEM Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL di stock in 500 mL di DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Mezzi di espansione) | Concentrazione finale | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0,5 &; M |
| Adv+++ | preparare fino a 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1,25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In casa* | 10% | |
| Inibitore P38 (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µ M |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | Interno* | 20% | |
| Wnt3a CM | In casa* | 50% | |
| In house* - le linee cellulari saranno fornite su richiesta | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Mezzi di differenziazione) | Per differenziare gli organoidi, gli organoidi dell'intestino tenue in espansione sono stati coltivati in un terreno ricco di Wnt per sei o sette giorni dopo la scissione, e poi cresciuti in un mezzo di differenziazione (ritiro di Wnt, nicotinamide, SB202190, in un mezzo di differenziazione (ritiro di Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandina E2 da un mezzo ricco di Wnt o OME) | ||
| MEZZO ORGANOIDE POLMONARE- LOM (Terreno di differenziazione) | Concentrazione finale | ||
| Adv+++ | preparare fino a 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0,0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-acetilcisteina | Sigma | A9125-25G | 1,25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contatta l'azienda direttamente | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µ M |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2,5 µ m |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contatta l'azienda direttamente | 10% |
| Tampone riducente (per la risospensione di oocisti e sporozoiti per iniezione) | Concentrazione finale | ||
| L-Glutatione ridotto | Sigma | G4251-10MG | 0,5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM |
| Betaina | Sigma | 61962 | 0.5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM |
| L-Cisteina | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM |
| Acido linoleico | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μ g/mL di OME/OMD /LOM |
| Taurina | Sigma | T0625-10MG | 0,5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM |
| Tampone bloccante (per colorazione con immunofluorescenza) | Concentrazione finale | ||
| Siero d'asino/capra | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Preparare fino a 100 ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0,1% |
| Elenco degli anticorpi utilizzati | |||
| Alexa 568 capra anti-coniglio | Invitrogen | A-11011 | Diluizione-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Anticorpo marcato con fluoresceina Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Diluizione- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Perle magnetiche rivestite con anticorpo monoclonale reattivo | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Diluizione-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Diluizione-1:1.000; RRID : AB_2629482 |
| falloidina-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Diluizione-1:1.000; RRID: AB_2620155 |
| anticorpo anti-gp15 di coniglio generato da R. M. O' Connor (co-autore). | Su richiesta | Su richiesta | Diluizione-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Diluizione- 1:200 |
Riferimenti
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al.
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Ristampe e permessi
