En mus modell av vascularized Heterotopic milt transplantasjon for å studere milt Cell Biology og Transplant immunitet

Summary

Denne protokollen detaljer kirurgiske trinn av en mus modell av vascularized heterotopic milt transplantasjon, en teknisk utfordrende modell som kan tjene som et kraftig verktøy i å studere skjebnen og lang levetid på milt celler, mekanismene av distinkte milt celle populasjoner i sykdomsprogresjon, og transplantasjon immunitet.

Abstract

Milten er en unik lymfoide organ som spiller en avgjørende rolle i homeostase av immun-og blodkreft systemer. Pasienter som har gjennomgått splenektomi uavhengig av fremskynde årsaker er tilbøyelige til å utvikle en overveldende post-splenektomi infeksjon og oppleve økt risiko for dyp venetrombose og ondartet. Nylig Epidemiologiske studier indikerte at splenektomi kan være forbundet med forekomsten av hjerte-og karsykdommer, noe som tyder på at fysiologiske funksjoner av milten ennå ikke er fullstendig anerkjent. Her introduserer vi en mus modell av vascularized heterotopic milt transplantasjon, som ikke bare kan utnyttes til å studere funksjonen og atferdsdata aktivitet av milt immun celle undergrupper i ulike biologiske prosesser, men også kan være et kraftig verktøy for å teste terapeutisk potensialet av milt transplantasjon i visse sykdommer. De viktigste kirurgiske trinnene i denne modellen inkluderer donor milt innhøsting, fjerning av mottakeren innfødte milt, og milt pode revaskularisering. Ved hjelp av congenic mus stammer (f. eks, mus med CD 45.1/CD 45.2 bakgrunner), observerte vi at etter syngeneic transplantasjon, både donor-avledet milt lymfocytter og myelogen celler migrert ut av pode så tidlig som postoperativ dag 1, samtidig med tilstrømningen av flere typer mottaker celler, og dermed generere en unik Chimera.  Til tross for relativt utfordrende teknikker, kan denne fremgangsmåten utføres med > 90% suksess rate. Denne modellen gjør det mulig å spore skjebnen, lang levetid, og funksjon av splenocytes under steady state og i en sykdom innstilling etter en milt transplantasjon, og dermed tilbyr en flott mulighet til å oppdage den distinkte rolle for milt-avledet immunceller i ulike sykdoms prosesser.

Introduction

Milten er den største sekundære lymfoide organ i kroppen og er kritisk i immun-og blodkreft systemer. Dens funksjoner er hovedsakelig utført av to morfologisk distinkte rom, den røde massen og den hvite Pulp¹. Den røde massen er en tredimensjonal meshwork av venøs bihulene og milt snorer som består av retikulære fibre, retikulære celler, og tilhørende makrofager. Denne unike strukturen gjør at den røde massen til å fungere som en effektiv blod filter som fjerner fremmede materialer og gamle eller ødelagte erytrocytter. Den hvite massen inneholder hårsekker, marginal sone, og periarteriolar lymfoide hylser (PALS) og er et viktig sted for antigen fangst og prosessering, lymfocytter homing, transformasjon, spredning, og modning². Likevel, milten har ofte blitt betraktet som en unnværlig organ fordi andre lymfatisk organer, som lymfeknuter, kan også utføre noen av sine funksjoner og tap av milt ikke fører vanligvis til døden. Splenektomi har derfor vært mye utført som en terapeutisk metode for pasienter med milt Kader eller godartet Hematologic sykdommer³. Men pasienter med splenektomi står overfor en rekke langsiktige komplikasjoner. Bakterielle infeksjoner er de mest anerkjente komplikasjoner av splenektomi. Nylig har den overveldende post-splenektomi sepsis blitt anerkjent som en intensiv komplikasjon av splenektomi forbundet med en høy dødelighet⁶. Videre viser de siste epidemiologiske studiene at splenektomi kan knyttes til forekomsten av hjerte-og karsykdommer, noe som tyder på at ytterligere fysiologiske funksjoner i milten gjenstår å utforskes^7,8.

Både milt autotransplantation og milt allografting har blitt utnyttet i klinikken. For tiden, milt autotransplantation av implanting deler av milt vev i poser opprettet i større segl regnes som den eneste muligheten for å bevare milt funksjon etter traumatisk splenektomi^9,10. Imidlertid er effekten av denne operasjonen diskuteres som post-kirurgi komplikasjoner som aseptisk nekrose av milt vev og små tarm obstruksjon på grunn av postoperativ adhesjon kan forekomme¹¹. Milt allografting er involvert i multivisceral transplantasjon¹². Kliniske bevis fra multivisceral transplantasjon tyder på at milten allografting kan spille en beskyttende rolle i små tarm allograft avvisning uten å forårsake pode-versus-host sykdom (GVHD)¹². Likevel litteratur om den gunstige effekten av milt allografting som en del av multivisceral transplantasjon er fortsatt begrenset, og de underliggende mekanismene gjenstår å bli definert. I 2006 rapporterte Yair Reisner et al. at transplantere gris embryonale milt vev som ikke har T-celler til mus kunne kurere hemofili A, en genetisk sykdom uten å forårsake GVHD¹³, som støtter at milt transplantasjon holder terapeutisk løfte i visse sykdommer. Derfor er det behov for videre undersøkelser om det terapeutiske potensialet for milt transplantasjon.

Animal modeller av milt transplantasjon er verdifulle for å utforske verdsatt funksjon av milt-avledet immunceller i sykdomsprogresjon, samt å teste den potensielle terapeutiske effekten av milt transplantasjon. Det er dokumentert at de har blitt sett på som en av de eksperimentelle hel miltenmodellene siden tidlig på 1900-tallet. I 1969, Coburn Richard J. og Lee et al. detaljert teknikken for milt transplantasjon hos rotter^15,16. Flere nylig, Swirski FK et al. beskrev en mus modell av milt transplantasjon¹⁷. Sammenlignet med rotte modeller, mus modeller av milt transplantasjon er mer attraktive på grunn av sine mange iboende fordeler. Ved å bruke en musemodell, kan vi for eksempel få tilgang til et omfattende utvalg av reagenser som ikke er tilgjengelige for rotte modellene. Videre, ved å bruke congenic mus (f. eks, mus med CD 45.1/CD 45.2 bakgrunn), en syngeneic milt transplantasjon gjør det mulig å spore skjebnen, lang levetid, og funksjon av splenocytes¹⁸. Basert på arbeidet med Swirski FK et al.¹⁷, vi videre etablert denne forenklet og forbedret protokoll for milt transplantasjon i mus. Protokollen beskrevet nedenfor kombinerer både pålitelighet og gjennomførbarhet på en standardisert måte og kan benyttes som et verktøy for å studere milt biologi og transplantasjon immunitet.

Protocol

Alle prosedyrer og dyr bruk i denne studien ble utført i henhold til protokoller godkjent av Northwestern University intern Animal Care og use Committee (IACUC). I denne studien, 8 til 10 uker gamle mannlige CD 45.2 og CD 45.1 mus (både på BALB/c bakgrunn, fra Jackson laboratorium) ble brukt som milt donorer og mottakere, henholdsvis å lage syngeneic milt transplantasjon modeller. Alle dyrene ble plassert i det sterile miljøet i dyret fasiliteter ved Northwestern University. Øye smøremiddelet ble påført alle mus…

Representative Results

Hele prosedyren for mus milt transplantasjon kan gjennomføres innen 90 min av erfarne microsurgeons. Vårt laboratorium har utført over 100 milt transplantasjon hos mus. Suksessen rate er over 90%, som definert av overlevelse av både mottaker mus og milt pode til post-operative dag (POD) 1 eller POD 7 (vår studie endepunkt). Overlevelsen av milten pode ble bekreftet av makroskopisk utseende og flyt flowcytometri analyse av splenocytes. Basert på vår erfaring, er flyt flowcytometri a…

Discussion

Overbevisende bevis tyder på at milt-avledet monocytter spiller en viktig rolle i sterile inflammatoriske prosesser som aterosklerose¹⁹, akutt iskemiske hjerne²⁰ eller lungeskade¹⁸, samt hjerte-i/R skade og remodeling^21,22,23. Disse rapportene markere under-anerkjennelse rolle milten i mange kroniske sykdommer, hvorav hjerte-og karsykdommer er en viktig en …

Materials

Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955