En muse model af vascularized Heterotopic milt transplantation for at studere milt cellebiologi og transplantations immunitet

Summary

Denne protokol beskriver de kirurgiske trin af en musemodel af vaskulariseret heterotop milt transplantation, en teknisk udfordrende model, der kan tjene som et kraftfuldt værktøj til at studere skæbne og levetiden af milt celler, mekanismerne i distinkte milt cellepopulationer i sygdomsprogression og transplantations immunitet.

Abstract

Milten er et unikt lymfoid organ, der spiller en afgørende rolle i homøostase af immun-og hæmatopoietiske systemer. Patienter, der har gennemgået splenektomi uanset udfældende årsager, er tilbøjelige til at udvikle en overvældende post-splenektomi infektion og opleve øget risiko for dyb venetrombose og maligniteter. For nylig indikerede epidemiologiske undersøgelser, at splenektomi kan være forbundet med forekomsten af hjerte-kar-sygdomme, hvilket tyder på, at de fysiologiske funktioner i milten endnu ikke er fuldt ud anerkendt. Her introducerer vi en musemodel af vaskulariseret heterotop milt transplantation, som ikke kun kan udnyttes til at studere funktion og adfærdsmæssige aktivitet af spleniske immuncelle undersæt i forskellige biologiske processer, men også kan være et kraftfuldt værktøj til at teste det terapeutiske potentiale af milt transplantation i visse sygdomme. De vigtigste kirurgiske trin i denne model omfatter donor milt høst, fjernelse af recipient indfødte milt, og milt graft revascularization. Ved hjælp af kongeniske muse stammer (f. eks. mus med CD 45.1/CD 45.2 baggrunde) observerede vi, at både donor-afledte spleniske lymfocytter og myeloide celler, der blev migreret ud af transplantatet så tidligt som postoperative dag 1, samtidig med tilstrømningen af flere typer af modtager celler, hvilket skaber en unik Chimera.  På trods af relativt udfordrende teknikker, denne procedure kan udføres med > 90% succesrate. Denne model gør det muligt at spore den skæbne, levetid, og funktion af splenocytes under Steady State og i en sygdom indstilling efter en milt transplantation, hvilket giver en stor mulighed for at opdage den særskilte rolle for milt-afledte immunceller i forskellige sygdomsprocesser.

Introduction

Milten er den største sekundære lymfoide organ i kroppen og er kritisk i immun og hæmatopoietiske systemer. Dens funktioner er primært udført af to morfologisk adskilte rum, den røde pulp og den hvide pulp¹. Den røde pulp er en tredimensionel trabekelværket af venøse bihuler og milt ledninger, der består af rekulære fibre, rekulære celler, og tilhørende makrofager. Denne unikke struktur gør det muligt for den røde Pulp at fungere som et effektivt blod filter, der fjerner fremmede materialer og gamle eller beskadigede erythrocytter. Den hvide pulp omfatter follikler, marginal zone, og periarteriolar lymfoide skeder (Pals) og er et vigtigt sted for antigen fældefangst og forarbejdning, lymfocyt homing, transformation, proliferation, og modning². Ikke desto mindre, milten har almindeligvis været betragtet som en udgivende organ, fordi andre lymfe organer, såsom lymfeknuder, kan også udføre nogle af sine funktioner og tabet af milt ikke normalt fører til døden. Splenektomi er derfor blevet bredt udført som en terapeutisk metode til patienter med milt skade eller benign hæmatologiske sygdomme³. Men, patienter med splenektomi står over for en række langsigtede komplikationer. Bakterielle infektioner er de bedst kendte komplikationer af splenektomy^4,5. For nylig, den overvældende post-splenektomi sepsis er blevet anerkendt som en intensiv komplikation af splenektomi forbundet med en høj dødelighed⁶. Desuden tyder nylige epidemiologiske undersøgelser på, at splenektomi kan være forbundet med forekomsten af hjerte-kar-sygdomme, hvilket tyder på, at yderligere fysiologiske funktioner i milten stadig skal udforskes med^7,8.

Både milt autotransplantation og milt allotransplantation er blevet udnyttet i klinikken. I øjeblikket anses milt autotransplantation ved at implanterer sektioner af splenisk væv i poser, der er skabt i Greater omentum, som den eneste mulighed for at bevare splenisk funktion efter traumatisk splenektomi^9,10. Men, effekten af denne operation kan diskuteres som post-kirurgi komplikationer som aseptisk nekrose af milt væv og små tarmobstruktion på grund af postoperative klæbestoffer kan forekomme¹¹. Milt allotransplantation er involveret i multi visceral transplantation¹². Klinisk evidens fra multi visceral transplantation tyder på, at milt allotransplantation kan spille en beskyttende rolle i små tarm allograft afvisning uden at forårsage graft-versus-Host sygdom (GVHD)¹². Men litteraturen om den gavnlige virkning af milt allotransplantation som bestanddel af multi visceral transplantation er stadig begrænset, og de underliggende mekanismer mangler at blive defineret. I 2006, Yair Reisner et al. rapporterede, at transplantations svin embryonale milt væv, der ikke har T-celler til mus kan helbrede hæmofili A, en genetisk sygdom uden at forårsage GVHD¹³, støtte, at milt transplantation holder terapeutiske løfte i visse sygdomme. Der er derfor behov for yderligere undersøgelser af det terapeutiske potentiale ved milt transplantation.

Dyremodeller af milt transplantation er værdifulde til at udforske den upåskønnede funktion af milt-afledte immunceller i sygdomsprogression samt til at teste den potentielle terapeutiske virkning af milt transplantation. Eksperimentelle hele milt transplantations modeller er blevet dokumenteret siden begyndelsen af 1900-tallet, som revideret af Cohen¹⁴. I 1969, Coburn Richard J. og Lee et al. detaljeret teknikken til milt transplantation i rotter^15,16. For nylig beskrev Swirski FK et al. en musemodel af milt transplantation¹⁷. Sammenlignet med rotte modeller, musemodeller af milt transplantation er mere attraktive på grund af dens mange iboende fordele. For eksempel ved at udnytte en musemodel, kan vi få adgang til en ekspansiv række reagenser utilgængelige for at af rotte modeller. Ved at bruge kongeniske mus (f. eks. mus med CD 45.1/CD 45.2 baggrund) gør en syngeneisk milt transplantation det muligt at spore den skæbne, levetid og funktion af splenocytter¹⁸. Baseret på det arbejde, som Swirski FK et al.¹⁷, vi yderligere etableret denne forenklede og forbedrede protokol af milt transplantation i mus. Den protokol, der er beskrevet nedenfor kombinerer både pålidelighed og gennemførlighed på en standardiseret måde og kan udnyttes som et redskab til at studere milt biologi og transplantation immunitet.

Protocol

Alle procedurer og dyre brug i denne undersøgelse blev udført i henhold til protokoller godkendt af det nordvestlige Universitets interne udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC). I denne undersøgelse, 8 til 10 uge gamle mandlige CD 45.2 og CD 45.1 mus (både på Balb/c baggrund, fra Jackson laboratorium) blev brugt som milt donorer og recipienter, henholdsvis at skabe murinsynogene milt transplantation modeller. Alle dyr blev anbragt i det sterile miljø i dyre faciliteterne på Northwestern University. Øjen smøremid…

Representative Results

Hele proceduren for mus milt transplantation kan afsluttes inden for 90 min af erfarne mikrokirurger. Vores laboratorium har udført over 100 milt transplantationer i mus. Succesraten er over 90%, som defineret ved overlevelse af både modtager mus og milt transplantatet til postoperative dag (POD) 1 eller POD 7 (vores undersøgelse Endpoint). Overlevelsen af milt transplantatet blev bekræftet af splenocytterne ved makroskopisk udseende og flow cytometri analyse. Baseret på vores erfari…

Discussion

Overbevisende beviser antyder, at milt-afledte monocytter spiller en vigtig rolle i sterile inflammatoriske processer såsom åreforkalkning¹⁹, akut iskæmisk hjerne²⁰ eller lungeskade¹⁸, samt myokardial I/R skade og remodeling^21,22,23. Disse rapporter fremhæver under-anerkendelse rolle milten i mange kroniske sygdomme, hvoraf hjerte-kar-sygdom er en vigtig…

Materials

Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955