إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لمعالجة نخاع العظم الطازج (BM) معزولة عن الماوس أو الإنسان لالكتلة عالية الأبعاد الخلايا (الخلايا من قبل وقت الرحلة، CyTOF) تحليل الخلايا العدلية النسب.
Abstract
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول احسن للحفاظ على الخلايا العدلية النسب في BM الطازجة لتحليل كامل BM CyTOF. لقد استخدمنا لوحة ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد للأجسام المضادة ثلاثية الأبعاد لتقييم نظام الخلايا الدموية مع التركيز على خلايا العدلات السلالة باستخدام هذا البروتوكول. تم تحليل نتيجة CyTOF مع خوارزمية الحد من الأبعاد مفتوحة المورد، viSNE، وقدمت البيانات لإظهار نتيجة هذا البروتوكول. لقد اكتشفنا مجموعات خلايا جديدة على أساس هذا البروتوكول. هذا البروتوكول من إعداد BM كاملة جديدة يمكن استخدامها ل1)، وتحليل CyTOF لاكتشاف مجموعات الخلايا غير معروف من BM كله، 2)، والتحقيق في عيوب BM كاملة للمرضى الذين يعانون من اضطرابات الدم مثل سرطان الدم، 3)، والمساعدة في تحسين الفلورسنت تنشيط تدفق البروتوكولات السيتوميالتي تستخدم BM كامل الطازجة.
Introduction
في العقود القليلة الماضية، كانت أساليب القياس السيتومي أداة قوية للتحقيق في نظام المكون ة في BM. وتشمل هذه الأساليب الفلورسنت تنشيط تدفق السيل والطريقة الجديدة من CyTOF باستخدام الأجسام المضادة الثقيلة التي تحمل علامات المعادن. وقد أدت إلى اكتشافات العديد من أنواع الخلايا في عينة بيولوجية غير متجانسة عن طريق تحديد ملامح التعبير فريدة من نوعها علامة السطح. يؤدي تداخل الطيف المتزايد المرتبط بالمزيد من القنوات إلى عدم دقة البيانات في تطبيقات قياس الدفق الفلوري. لذلك، تتم إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بشكل روتيني من أجل إثراء مجموعات الخلايا ذات الأهمية لتحليل الخلايا المتدفقة المنشط الفلورسنت. على سبيل المثال، تعتبر Ly6G (أو Gr-1) و CD11b علامات الخلايا النخاعية الناضجة وLy6G+ (أو Gr-1+) وCD11b+ الخلايا تتم إزالتها بشكل روتيني من عينات BM باستخدام مجموعات التخصيب المغناطيسي قبل تحليل الخلايا المتدفقة من الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (HSPCs) أو من خلال الجمع بين هذه العلامات في قناة واحدة تفريغ كوكتيل1،2،3. مثال آخر هو أن العدلات تتم إزالتها بشكل روتيني من عينة الدم البشري لإثراء خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMC) للدراسات المناعية. نخاع العظم كله معزولة عن الماوس أو الإنسان، ومع ذلك، نادرا ما يتم التحقيق سليمة لتحليل الخلايا.
في الآونة الأخيرة، أصبح CyTOF أداة ثورية للتحقيق في نظام المكونة للدم4،5،6. مع CyTOF، يتم استبدال الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلوروفور بالأجسام المضادة الثقيلة التي تحمل اسم المراسل. وتتيح هذه الطريقة قياس أكثر من 40 علامة في آن واحد دون الاهتمام بتداخل الطيف. وقد مكّن ذلك من تحليل العينة البيولوجية السليمة دون خطوات ما قبل الاستنفاد أو قناة تفريغ. ولذلك، يمكننا أن نرى نظام المكونة للدم بشكل شامل مع الأبعاد عالية المحتوى من التقليدية 2-D مخطط الانسيابية. يمكن الآن جلب مجموعات الخلايا التي تم حذفها في الماضي أثناء عملية الاستنفاد أو الضخ إلى النور مع البيانات عالية الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة CyTOF4،5. لقد صممنا لوحة الأجسام المضادة التي تقيس في وقت واحد 39 المعلمات في نظام المكونة للدم مع التركيز على linage النخاعي7. بالمقارنة مع البيانات التقليدية للتدفق الخلوي، فإن تفسير وتصور البيانات عالية الأبعاد غير المسبوقة أحادية الخلية التي تولدها CyTOF أمر صعب. وقد طور العلماء الحسابية تقنيات الحد من البعد من أجل تصور مجموعات البيانات عالية الأبعاد. في هذه المقالة، استخدمنا الخوارزمية، viSNE، والتي تستخدم تقنية T-توزيع الجار الاستوتشاستيك (t-SNE) لتحليل بيانات CyTOF وتقديم نتيجة عالية الأبعاد على خريطة ثنائية الأبعاد مع الحفاظ على بنية عالية الأبعاد من البيانات8،9،10. على مؤامرة tSNE، يتم تجميع خلايا مماثلة في مجموعات فرعية ويتم استخدام اللون لتمييز ميزة الخلايا. على سبيل المثال، في الشكل 1 يتم توزيع الخلايا النخاعية في عدة مجموعات فرعية الخلية على أساس أوجه التشابه من أنماط التعبير عن 33 علامات السطح الناجمة عن CyTOF (الشكل 1)4. هنا نحن التحقيق نخاع عظم الماوس مع لدينا ذكرت سابقا 39-علامة لوحة CyTOF بواسطة تحليل viSNE7. كشف تحليل viSNE لبيانات نا سيف عن مجموعة خلايا غير محددة أظهرت كلا HSPC (CD117+) والعدلات (Ly6G+) خصائص (الشكل 2)7.
في الختام، نقدم بروتوكولا لمعالجة نخاع العظم كله الطازجة لتحليل CyTOF. في هذه المقالة، استخدمنا نخاع عظم الفأر كمثال، في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لمعالجة عينات نخاع العظم البشري. كما أن التفاصيل الخاصة بعينات نخاع العظم البشري مذكورة في البروتوكول أيضاً. ميزة هذا البروتوكول هو أنه يحتوي على تفاصيل مثل وقت الحضانة ودرجة الحرارة التي تم تحسينها للحفاظ على خلايا العدلة النسب في نخاع العظام كله لتمكين التحقيق على نخاع العظام كله سليمة. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتطبيقات قياس الدفق الفلوري.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العقود الماضية، تم استخدام الفلورية القائمة على الخلايا تدفق كوسيلة رئيسية لدراسة السلالات الخلوية والتباين1،2،3. وعلى الرغم من أن قياس التدفق السيتومتري قد وفر بيانات متعددة الأبعاد، فإن هذه الطريقة محدودة بخيارات البارامترات والتد…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر النواة LJI تدفق الCytometry للمساعدة في إجراء قياس السيل الشامل. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01HL134236، P01HL136275، و R01CA202987 (جميعها إلى C.C.H) و ADA7-12-MN-31 (04) (إلى C.C.H. و Y.P.Z).
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Riferimenti
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).
