Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at behandle frisk knoglemarv (BM) isoleret fra mus eller human for high-dimensionelle masse cytometri (flowcytometri af Time-of-Flight, cytof) analyse af neutrofile-Lineage celler.
Abstract
I denne artikel præsenterer vi en protokol, der er optimeret til at bevare neutrofile-Lineage celler i frisk BM for hele BM CyTOF analyse. Vi udnyttede en myeloid-partisk 39-antistof CyTOF panel til at evaluere det hæmatopoietiske system med fokus på neutrofile-Lineage celler ved hjælp af denne protokol. CyTOF-resultatet blev analyseret med en dimensional reduktions algoritme med åben ressource, viSNE, og dataene blev præsenteret for at demonstrere resultatet af denne protokol. Vi har opdaget nye neutrofile-Lineage cellepopulationer baseret på denne protokol. Denne protokol af friske hele BM præparat kan anvendes til 1), CyTOF analyse at opdage uidentificerede cellepopulationer fra hele BM, 2), undersøge hele BM defekter for patienter med blodsygdomme såsom leukæmi, 3), bistå optimering af Fluorescens-aktiverede flow cytometri protokoller, der udnytter frisk hele BM.
Introduction
I de sidste par årtier, cytometri metoder har været et effektivt redskab til at undersøge det hæmatopoietiske system i BM. Disse metoder omfatter fluorescens-aktiveret flow cytometri og den nye metode til CyTOF ved hjælp af heavy metal-mærkede antistoffer. De har ført til opdagelser af mange celletyper i en heterogen biologisk prøve ved identifikation af deres unikke overflade markør udtryks profiler. Øget spektrum overlapninger, der er forbundet med flere kanaler fører til højere data unøjagtighed i fluorescens-aktiverede flow cytometri applikationer. Derfor fjernes uønskede celler rutinemæssigt for at berige cellepopulationer af interesse for fluorescens-aktiverede flow cytometri analyse. For eksempel, Ly6G (eller gr-1) og CD11b betragtes modne myeloid celle markører og Ly6G+ (eller gr-1+) og CD11b+ celler rutinemæssigt fjernes fra BM prøver ved hjælp af magnetisk berigelse kits før flow cytometri analyse af hæmatopoietisk stilk og progenitorceller (hspc’er) eller ved at kombinere disse markører i en dump cocktail Channel1,2,3. Et andet eksempel er, at neutrofiler rutinemæssigt fjernes fra humant blodprøve for at berige perifert blod mononukleære celler (PBMC) til immunologiske undersøgelser. Hele knoglemarv isoleret fra mus eller menneske, dog, er sjældent undersøgt intakt for cytometri analyse.
For nylig er cytof blevet et revolutionerende værktøj til at undersøge det hæmatopoietiske system4,5,6. Med CyTOF erstattes de fluorofore-mærkede antistoffer af tunge element reporter-mærkede antistoffer. Denne metode giver mulighed for måling af over 40 markører samtidig uden bekymring for spektrum overlap. Det har gjort det muligt at analysere intakt biologisk prøvemateriale uden præ-depletering trin eller en dump kanal. Derfor kan vi se det hæmatopoietiske system omfattende med højt indhold dimensionalitet fra konventionelle 2-D flow cytometri plots. Cellepopulationer, der tidligere er udeladt under nedbrydningen eller gating-processen, kan nu bringes i lys med de højdimensionelle data genereret af cytof4,5. Vi har designet et antistof panel, der samtidig måler 39 parametre i det hæmatopoietiske system med fokus på myeloid Linage7. Sammenlignet med de konventionelle flow cytometri data, er fortolkningen og visualiseringen af de hidtil usete encellehøjdimensionelle data genereret af CyTOF udfordrende. Computational forskere har udviklet dimensionalitet reduktionsteknikker til visualisering af High-dimensionelle datasæt. I denne artikel, vi brugte algoritmen, viSNE, som bruger t-Distributed Stochastic nabo Embedding (t-SNE) teknik til at analysere CyTOF data og til at præsentere det høje-dimensionelle resultat på en 2-dimensionelle kort samtidig bevare den høje-dimensionelle struktur af data8,9,10. På tSNE-plottet grupperes lignende celler i undersæt, og farven bruges til at fremhæve cellens funktion. For eksempel, på figur 1 de myeloide celler fordeles i flere celle undergrupper baseret på lighederne i deres udtryks mønstre af 33 overflade markører skyldes cytof (figur 1)4. Her undersøgte vi musens knoglemarv med vores tidligere rapporterede 39-markør CyTOF-panel af viSNE-analyse7. viSNE-analysen af vores CyTOF-data afslørede en uidentificeret cellepopulation, der viste både HSPC (CD117+) og neutrofile (Ly6G+) karakteristika (figur 2)7.
Afslutningsvis præsenterer vi en protokol til at behandle frisk hele knoglemarv til CyTOF analyse. I denne artikel, vi brugte mus knoglemarv som et eksempel, mens denne protokol også kan bruges til at behandle menneskelige knoglemarvsprøver. De oplysninger, der er specifikke for humane knoglemarvsprøver er også noteret i protokollen så godt. Fordelen ved denne protokol er, at den indeholder detaljer såsom inkubationstid og temperatur, der blev optimeret for at bevare neutrofillineceller i hele knoglemarven for at muliggøre undersøgelse af den intakte hel knoglemarv. Denne protokol kan også let ændres for fluorescens-aktiverede flow cytometri applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de seneste årtier, fluorescens-baserede flow cytometri blev anvendt som den vigtigste metode til at studere cellulære slægter og heterogenitet1,2,3. Selvom flow cytometri har givet flerdimensionelle data, er denne metode begrænset af valg af parametre og spektral overlap. For at overvinde den svage flow cytometri udnyttede vi CyTOF, som bruger tungmetaller isotoper i stedet for fluorophores til at mærke antistoffer, der e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke lji flow flowcytometri kerne for hjælp med masse cytometri procedure. Dette arbejde blev støttet af NIH Grants R01HL134236, P01HL136275 og R01CA202987 (alle til C. C. H) og ADA7-12-MN-31 (04) (til C.C.H. og Y. P. Z).
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Riferimenti
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).
