Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l’homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.
Abstract
Dans cet article, nous présentons un protocole qui est optimisé pour préserver des cellules de neutrophile-ligne dans BM frais pour l’analyse entière de CyTOF de BM. Nous avons utilisé un panneau CyTOF de 39 anticorps myéloïde-biaisé pour évaluer le système hématopoïétique avec un foyer sur les cellules de neutrophile-ligne en utilisant ce protocole. Le résultat de CyTOF a été analysé avec un algorithme de réduction dimensionnelle à ressources ouvertes, viSNE, et les données ont été présentées pour démontrer les résultats de ce protocole. Nous avons découvert de nouvelles populations de cellules de neutrophile basées sur ce protocole. Ce protocole de préparation bM entière fraîche peut être employé pour 1), analyse de CyTOF pour découvrir des populations non identifiées de cellules de BM entière, 2), étudiant des défauts entiers de BM pour des patients présentant des désordres de sang tels que la leucémie, 3), aidant l’optimisation de protocoles de cytométrie de débit fluorescence activés qui utilisent BM entier frais.
Introduction
Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d’écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d’expression de marqueurde de surface. L’augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence. Par conséquent, les cellules indésirables sont systématiquement enlevées afin d’enrichir les populations cellulaires d’intérêt pour l’analyse de cytométrie de débit activée par fluorescence. Par exemple, Les cellules Ly6G (ou Gr-1) et CD11b sont considérées comme des marqueurs de cellules myéloïdes matures et les cellules Ly6G(ou Gr-1)et CD11b sont systématiquement retirées des échantillons de BM à l’aide de kits d’enrichissement magnétique avant l’analyse de la cytométrie du flux. cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPC) ou en combinant ces marqueurs dans un canal de cocktail à décharge1,2,3. Un autre exemple est que les neutrophiles sont systématiquement retirés du spécimen de sang humain pour enrichir les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) pour des études immunologiques. La moelle osseuse entière isolée de la souris ou de l’homme, cependant, est rarement étudiée intacte pour l’analyse de cytométrie.
Récemment, CyTOF est devenu un outil révolutionnaire pour étudier le système hématopoïétique4,5,6. Avec CyTOF, les anticorps étiquetés fluorophore sont remplacés par des anticorps étiquetés par des journalistes à élément lourd. Cette méthode permet de mesurer plus de 40 marqueurs simultanément sans se soucier du chevauchement du spectre. Il a permis l’analyse d’un spécimen biologique intact sans étapes de pré-épuisement ou d’un canal de vidange. Par conséquent, nous pouvons voir le système hématopoïétique de manière complète avec la dimensionnalité à haute teneur à partir des parcelles conventionnelles de cytométrie de flux 2-D. Les populations cellulaires omises dans le passé lors de l’épuisement ou du processus de gating peuvent maintenant être mises en lumière avec les données de haute dimension générées par CyTOF4,5. Nous avons conçu un panneau d’anticorps qui mesure simultanément 39 paramètres dans le système hématopoïétique avec un accent sur le linage myéloïde7. Par rapport aux données conventionnelles de cytométrie de flux, l’interprétation et la visualisation des données unicellulaires sans précédent à haute dimensionnalité générées par CyTOF est un défi. Les scientifiques computationnels ont développé des techniques de réduction de dimensionnalité pour la visualisation des ensembles de données de haute dimension. Dans cet article, nous avons utilisé l’algorithme, viSNE, qui utilise t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) technique pour analyser les données CyTOF et de présenter le résultat de haute dimension sur une carte en 2 dimensions tout en conservant la structure de haute dimension des données8,9,10. Sur la parcelle tSNE, des cellules similaires sont regroupées en sous-ensembles et la couleur est utilisée pour mettre en évidence la caractéristique des cellules. Par exemple, à la figure 1, les cellules myéloïdes sont réparties dans plusieurs sous-ensembles cellulaires en fonction des similitudes de leurs modèles d’expression de 33 marqueurs de surface résultant de CyTOF (Figure 1)4. Ici nous avons étudié la moelle d’os de souris avec notre panneau précédemment rapporté de 39 marqueurs de CyTOF par l’analysedeviSNE 7. l’analyse viSNE de nos données CyTOF a révélé une population cellulaire non identifiée qui a montré à la fois HSPC (CD117)et neutrophiles (Ly6G)(figure2)7.
En conclusion, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse entière fraîche pour l’analyse de CyTOF. Dans cet article, nous avons utilisé la moelle osseuse de souris comme exemple, tandis que ce protocole peut également être utilisé pour traiter des échantillons de moelle osseuse humaine. Les détails spécifiques aux échantillons de moelle osseuse humaine sont également notés dans le protocole. L’avantage de ce protocole est qu’il contient des détails tels que le temps d’incubation et la température qui ont été optimisés pour préserver les cellules de neutrophile dans toute la moelle osseuse pour permettre l’investigation sur la moelle osseuse entière intacte. Ce protocole peut également être facilement modifié pour les applications de cytométrie de débit activée par fluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des dernières décennies, la cytométrie à base de fluorescence a été utilisée comme méthode principale pour étudier les lignées cellulaires et l’hétérogénéité1,2,3. Bien que la cytométrie de flux ait fourni des données multidimensionnelles, cette méthode est limitée par des choix de paramètres et de chevauchement spectral. Pour surmonter la faiblesse de la cytométrie d’écoulement, nous avons profit?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie de flux de LJI pour l’aide avec la procédure de cytométrie de masse. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01HL134236, P01HL136275, et R01CA202987 (tous à C.C.H) et ADA7-12-MN-31 (04) (à C.C.H. et Y.P.Z).
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Riferimenti
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