CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.
Summary
여기에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 CAR-T 세포를 유전적으로 편집하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암에 대한 최첨단 잠재적으로 혁명적 인 새로운 치료 옵션입니다. 그러나, 암의 치료에 그것의 광범위 한 사용에 상당한 제한이 있다. 이러한 제한은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 신경 독성 (NT) 및 고형 종양에서 제한된 확장, 이펙터 기능 및 항 종양 활성과 같은 독특한 독성의 개발을 포함한다. CAR-T 효능및/또는 CAR-T 세포의 독성을 조절하는 한 가지 전략은 CAR-T 세포 제조 중에 CAR-T 세포의 게놈을 스스로 편집하는 것입니다. 여기에서, 우리는 과립구 대식세포 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 Cas9에 가이드 RNA를 포함하는 렌티 바이러스 구조를 가진 transduction를 통해 CAR-T 세포에 있는 CRISPR/Cas9 유전자 편집의 사용을 기술합니다. 예를 들어, 우리는 GM-CSF의 CRISPR / Cas9 중재 녹아웃을 설명합니다. 우리는 이 GM-CSFk/o CAR-T 세포가 중요한 T 세포 기능을 유지하면서 효과적으로 적은 GM-CSF를 생성하고 야생 형 CAR-T 세포에 비해 생체 내에서 향상된 항 종양 활성을 초래한다는 것을 보여주었습니다.
Introduction
키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암 치료에 큰 약속을 전시한다. 1개 , 2 CD19(CART19)를 표적으로 하는 2개의 CAR-T 세포 치료는 다중 센터 임상 시험에서 눈에 띄는 결과를 입증한 후에 B 세포 악성에 있는 사용을 위해 최근 유나이티드 명시된 및 유럽에서 승인되었습니다. 3개 , 4개 , 5 CAR-T 세포의 보다 광범위한 사용에 대한 장벽은 고형 종양에서 제한된 활성및 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경독성(NT)을 포함한 관련 독성이다. 3개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9 CAR-T 세포 치료의 치료 지수를 향상시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR과 같은 게놈 엔지니어링 도구가 덜 독성이 적거나 더 효과적인 CAR-T 세포를 생성하기 위해 CAR-T 세포를 추가로 수정하는 데 사용됩니다. 10개 , 11세
이 문서에서는 CRISPR/Cas9 편집된 CAR-T 셀을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 특정 목표는 CRISPR/Cas9를 통해 CAR-T 세포 제조 중에 CAR-T 세포를 유전적으로 수정하여 독성이 적거나 더 효과적인 CAR-T 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법론을 개발하기위한 근거는 CAR-T 세포 치료의 치료 기간을 증가시키고 응용 프로그램을 확장하기 위한 새로운 전략이 절실히 필요하다는 것을 나타내는 CAR-T 세포 치료의 임상 경험에서 얻은 교훈을 기반으로 합니다. 그밖 종양은 병원에 들어가기 시작한 CAR-T 세포의 다중 수정을 허용하는 합성 생물학에 있는 최근 어드밴스에 의해 지원됩니다. 아연 핑거 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR과 같은 여러 게놈 엔지니어링 도구가 개발되고 적용되고 있는 동안, 당사의 방법론은 CAR-T 세포의 CRISPR/Cas9 수정을 설명합니다. 10개 , 11 CRISPR/Cas9는 외래 DNA를 제거하도록 설계된 RNA 기반 세균 방어 메커니즘입니다. CRISPR은 가이드 RNA (gRNA)를 통해 확인된 표적 서열을 갈라기 위하여 endonucleases에 의존합니다. CAR-T 세포의 CRISPR 편집은 다른 게놈 엔지니어링 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이들은 gRNA 순서의 정밀도, 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 디자인하는 단순성, 높은 유전자 편집 효율성 및 다중 gRNA가 동시에 사용될 수 있기 때문에 다중 유전자를 표적으로 하는 기능.
구체적으로 여기에 기술된 방법에서, 우리는 CRISPR 가이드 RNA 및 Cas9를 코딩하는 렌티바이러스를 사용하여 T 세포의 CAR 주입 동안 유전자를 중단하였다. CAR-T 세포를 편집하기 위한 적절한 기술을 선택할 때, 여기서 설명한 기술은 연구 등급 CAR-T 세포를 생성하는 효율적인 메커니즘이지만, Cas9를 게놈에 영구적으로 통합하는 장기적인 효과는 알려지지 않기 때문에, 우리는 개념 연구 등급 CAR-T 세포의 증거를 개발하지만 좋은 제조 연습 학년 CAR-T 세포를 생산하지 않는이 방법론을 제안한다.
특히, 여기서 우리는 인간 CD19를 표적으로 하는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 녹아웃 CAR-T 세포의 생성을 기술한다. 이들 CAR-T 세포는 GM-CSF(유전자 명 CSF2) 및 Cas9에 특이적인 가이드 RNA를 코딩하는 렌티바이러스 입자를 가진 트랜스덕션에 의해 생성되었다. 우리는 이전에 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CRS 및 NT를 개량한다는 것을 발견했습니다. 12 개의 GM-CSFk/o CAR-T 세포는 제조 과정에서 GM-CSF의 억제를 허용하여 야생형 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 항종양 활성 및 생존을 향상시키면서 GM-CSF의 생산을 효과적으로 감소시킵니다. 12 따라서, 여기서 우리는 CRISPR/Cas9 편집된 CAR-T 세포를 생성하는 방법론을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에서는 CRISPR/Cas9 기술을 활용하여 CAR-T 세포의 이차 수정을 유도하는 방법론을 설명합니다. 구체적으로, 이것은 GM-CSFk/o CART19 세포를 생성하기 위해 관심 유전자및 Cas9를 표적화하는 gRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 이용한 렌티바이러스 트랜스덕션을 사용하여 입증된다. 우리는 이전에 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CRS 및 NT를 개량한다는 것을 보여주었습니다. 12<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 K12CA090628 (SSK), 국립 종합 암 네트워크 (SSK), 개별 의학메이요 클리닉 센터 (SSK), 프레돌린 재단 (SSK), 실천번역의 메이요 클리닉 사무소 (SSK) 및 보조금을 통해 지원되었습니다. 메이 요 클리닉 의료 과학자 교육 프로그램 로버트 L. 하웰 의사-과학자 장학금 (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
Riferimenti
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