Bruke CRISPR/Cas9 å Knock Out GM-CSF i CAR-T celler
Summary
Her presenterer vi en protokoll til genetisk redigere CAR-T-celler via en CRISPR/Cas9 system.
Abstract
Chimeric antigen reseptor T (CAR-T) celle terapi er en cutting edge og potensielt revolusjonerende ny behandling alternativ for kreft. Det er imidlertid betydelige begrensninger på utbredt bruk i behandling av kreft. Disse begrensninger inkludere utviklingen av enestående toksisitet som cytokin løslate Syndrome (CRS) og nevrotoksisitet (NT) og begrenset ekspansjon, effektor funksjonene, og anti-svulst aktivitet inne robust svulst. En strategi for å forbedre CAR-T effekt og/eller kontroll toksisitet av CAR-T-celler er å redigere Genova av CAR-T cellene selv under CAR-T celle produksjon. Her beskriver vi bruken av CRISPR/Cas9 genredigering i CAR-T-celler via Transduction med en lentiviral konstruksjon som inneholder en guide RNA for å granulocytt macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og Cas9. Som et eksempel, beskriver vi CRISPR/Cas9 mediert knockout av GM-CSF. Vi har vist at disse GM-CSFk/o Car-T-celler effektivt produsere mindre GM-CSF samtidig opprettholde kritisk T celle funksjon og resultere i forbedret anti-tumor aktivitet in vivo i forhold til vill type Car-t-celler.
Introduction
Chimeric antigen reseptor T (CAR-T) celle terapi utstillinger store løftet i behandling av kreft. 1 den andre , 2 to bil-T celle terapier rettet mot CD19 (CART19) ble nylig godkjent i United uttalte og i Europa for bruk i B-cellen ondartet etter å ha vist slående resultater i multisenter kliniske studier. 3 andre priser , 4 andre priser , 5 barrierer for mer utbredt bruk av Car-T-celler er begrenset aktivitet i solide svulster og tilhørende toksisitet inkludert cytokin Release syndrom (CRS) og NEVROTOKSISITET (NT). 3 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9 for å forbedre den terapeutiske indeks av Car-t celle terapi, er Genova tekniske verktøy som sink finger Nukleaser, TALENS og CRISPR ansatt for ytterligere å endre Car-t-celler i et forsøk på å generere mindre giftige eller mer effektive Car-t-celler. 10 andre , 11 flere
I denne artikkelen beskriver vi en metode for å generere CRISPR/Cas9 redigerte CAR-T-celler. Det konkrete målet med denne metoden er å genetisk modifisere CAR-T-celler under CAR-T celle produksjon via CRISPR/Cas9 å generere mindre giftige eller mer effektive CAR-T-celler. Begrunnelsen for å utvikle denne metodikken er bygget på erfaringene fra klinisk erfaring med CAR-T celle terapi, som indikerer et presserende behov for romanen strategier for å øke den terapeutiske vinduet i CAR-T celle terapi og å utvide programmet til andre svulster og støttes av den nylige fremskritt i syntetisk biologi slik at flere modifikasjoner av CAR-T-celler som har begynt å gå inn i klinikken. Mens flere Genova tekniske verktøy utvikles og brukes i forskjellige innstillinger, for eksempel sink finger nukleaser, TALENs og CRISPR, beskriver vår metodikk CRISPR/Cas9 modifikasjon av CAR-T-celler. 10 andre , 11 CRISPR/Cas9 er en RNA-basert bakteriell forsvarsmekanisme som er designet for å ELIMINERE utenlandsk DNA. CRISPR baserer på endonucleases på å holde en mål sekvens identifisert gjennom en guide RNA (gRNA). CRISPR redigering av CAR-T-celler tilbyr flere fordeler fremfor andre tekniske verktøy for Genova. Disse inkluderer presisjon av gRNA sekvensen, enkelhet å designe en gRNA rettet mot genet av interesse, høy genredigering effektivitet, og evnen til å målrette flere gener siden flere gRNAs kan brukes på samme tid.
Spesielt i metodene beskrevet her, brukte vi en lentivirus koding CRISPR guide RNA og Cas9 å forstyrre et gen under CAR Transduction av T-celler. I å velge en hensiktsmessig teknikk for å redigere CAR-T-celler, foreslår vi at teknikken som er beskrevet her er en effektiv mekanisme for å generere forskning grade CAR-T-celler, men fordi den langsiktige effekten av permanent integrering av Cas9 i Genova er ukjent, vi foreslå denne metodikken for å utvikle bevis på konseptet forskning grade CAR-T-celler, men ikke for å produsere god produksjon praksis grade CAR-T-celler.
Spesielt her beskriver vi generering av granulocytt macrophage koloni stimulerende faktor (GM-CSF) knockout CAR-T-celler rettet mot menneskelig CD19. Disse CAR-T celler ble generert av Transduction med lentiviral partikler koding en guide RNA spesifikke for GM-CSF (Gen navn CSF2) og Cas9. Vi har tidligere funnet ut at GM-CSF nøytralisering ameliorates CRS og NT i en xenograft modell. 12 GM-CSFk/o Car-T-celler tillater HEMMING av GM-CSF under produksjonsprosessen, effektivt redusere PRODUKSJONEN av GM-CSF samtidig forbedre Car-t celle anti-tumor aktivitet og overlevelse in vivo sammenlignet med wildtype Car-T-celler. 12 derfor, her gir vi en metodikk for å generere CRISPR/CAS9 redigert Car-T-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapporten beskriver vi en metodikk for å utnytte CRISPR/Cas9-teknologi for å indusere sekundære modifikasjoner i CAR-T-celler. Nærmere bestemt er dette demonstrert ved hjelp lentiviral Transduction med en viral vektor som inneholder gRNA rettet mot genet av interesse og Cas9 å generere GM-CSFk/o CART19 celler. Vi hadde tidligere vist at GM-CSF nøytralisering ameliorates CRS og NT i en xenograft modell. 12 som tidligere beskrevet, GM-CSFk/o Car-T-celler tillater …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet gjennom tilskudd fra K12CA090628 (SSK), National Comprehensive Cancer Network (SSK), den Mayo Clinic Center for individualisert medisin (SSK), den Predolin Foundation (SSK), den Mayo Clinic Office of Translation til Practice (SSK), og den Mayo Clinic medisinsk forsker Training program Robert L. Howell lege-forsker stipend (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
Riferimenti
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Ricerca sul cancro. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
