Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para editar geneticamente as células CAR-T através de um sistema CRISPR/Cas9.
Abstract
A terapia de célula T (CAR-T) do receptor de antígeno quimérico é uma aresta de corte e uma nova opção de tratamento potencialmente revolucionária para câncer. No entanto, existem limitações significativas para o seu uso generalizado no tratamento do cancro. Estas limitações incluem o desenvolvimento de toxicidades originais tais como a síndrome da liberação do citocinas (CRS) e a neurotoxicidade (NT) e a expansão limitada, as funções efetoras, e a atividade antitumoral em tumores contínuos. Uma estratégia para melhorar a eficácia do CAR-T e/ou as toxicidades de controle das células CAR-t é editar o genoma das próprias células CAR-t durante a fabricação de células CAR-T. Aqui, nós descrevemos o uso da edição do gene de crispr/Cas9 em pilhas de Car-T através da transdução com uma construção lentivirais que contem um RNA do guia ao fator deestimulação da colônia do macrófago do granulocyte (GM-CSF) e Cas9. Como um exemplo, nós descrevemos o nocaute negociado CRISPR/Cas9 de GM-CSF. Nós mostramos que estas pilhas do carro-T do GM-CSFk/o produzem eficazmente menos GM-CSF ao manter a função crítica da pilha de t e resultam na atividade antitumoral aumentada in vivo comparada às pilhas selvagens do tipo Car-t.
Introduction
O receptor quimérico T do antígeno (carro-T) a terapia da pilha exibe a grande promessa no tratamento do cancro. 1. º , 2 duas terapias da pilha do carro-T que alvejaram CD19 (CART19) foram aprovadas recentemente nos Estados Unidos indicados e em Europa para o uso em malignidades da pilha de B após ter provado resultados impressionantes em ensaios clínicos multicêntrico. 3. º , 4. º , 5 as barreiras ao uso mais difundido de pilhas de Car-T são atividade limitada em tumores contínuos e em toxicidades associadas que incluem a síndrome da liberação do citocinas (CRS) e o neurotoxicidade (NT). 3. º , 5. º , 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9 para realçar o índice terapêutico da terapia da pilha de Car-t, as ferramentas da engenharia do genoma tais como nucleases do dedo do zinco, Talens, e crispr são empregadas para modificar mais pilhas de Car-t em uma tentativa de gerar umas pilhas menos tóxicas ou mais eficazes de Car-t. 10 de , 11 anos de
Neste artigo, descrevemos um método para gerar células CAR-T editadas CRISPR/Cas9. O objetivo específico deste método é modificar geneticamente as células CAR-T durante a fabricação de células Car-T via CRISPR/Cas9 para gerar células CAR-T menos tóxicas ou mais efetivas. A fundamentação para o desenvolvimento desta metodologia é construída sobre as lições aprendidas com a experiência clínica da terapia celular CAR-T, o que indica uma necessidade urgente de novas estratégias para aumentar a janela terapêutica da terapia celular CAR-T e estender a aplicação em outros tumores e é apoiado pelos recentes avanços na biologia sintética permitindo múltiplas modificações das células CAR-T que começaram a entrar na clínica. Enquanto várias ferramentas de engenharia do genoma estão sendo desenvolvidas e aplicadas em diferentes configurações, como nucleases de dedo de zinco, TALENs e CRISPR, nossa metodologia descreve a modificação de CRISPR/Cas9 de células CAR-T. 10 de , 11 crispr/Cas9 é um mecanismo de defesa bacteriano baseado em RNA que é projetado para eliminar o DNA externo. O CRISPR baseia-se em endonucleases para Cleave uma sequência alvo identificada através de um RNA guia (gRNA). A edição CRISPR das células CAR-T oferece várias vantagens sobre outras ferramentas de engenharia do genoma. Estes incluem a precisão da sequência gRNA, simplicidade para projetar um gRNA visando o gene de interesse, alta eficiência de edição de genes, e a capacidade de segmentar vários genética, uma vez que vários gRNAs podem ser usados ao mesmo tempo.
Especificamente nos métodos descritos aqui, foi utilizado um Lentivirus codificação CRISPR guia RNA e Cas9 para interromper um gene durante a transdução do carro de células T. Ao selecionar uma técnica apropriada para editar células CAR-T, sugerimos que a técnica descrita aqui seja um mecanismo eficiente para gerar células CAR-T de grau de pesquisa, mas porque o efeito a longo prazo da integração permanente de Cas9 no genoma é desconhecido, nós propor esta metodologia para desenvolver a prova de conceito de pesquisa de grau de células CAR-T, mas não para a produção de boas práticas de fabrico grau CAR-T células.
Em particular, aqui nós descrevemos a geração de granulocyte macrófago colônia fator estimulante (GM-CSF) Knockout CAR-T células visando a CD19. Essas células CAR-T foram geradas por transdução com partículas lentivirais codificando um RNA guia específico para GM-CSF (Gene Name CSF2) e Cas9. Nós encontramos previamente que a neutralização do GM-CSF melhora CRS e NT em um modelo do xenograft. 12 pilhas do GM-CSFk/o Car-t permitem a inibição do GM-CSF durante o processo de manufactura, reduzindo eficazmente a produção de GM-CSF ao realçar a atividade do anti-tumor da pilha de Car-t e a sobrevivência in vivo comparado às pilhas do tipo selvagem Car-t. 12 assim, aqui nós fornecemos uma metodologia para gerar crispr/Cas9 editado células Car-T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste relatório, nós descrevemos uma metodologia para utilizar a tecnologia de CRISPR/Cas9 para induzir modificações secundárias em pilhas de CAR-T. Especificamente, isso é demonstrado usando transdução lentivirais com um vetor viral que contém grna visando o gene de interesse e Cas9 para gerar células GM-CSFk/o CART19. Nós tínhamos mostrado previamente que a neutralização de GM-CSF melhora CRS e NT em um modelo do xenograft. 12 como descrito previamente, as pilhas do carr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado através de subvenções da K12CA090628 (SSK), da rede nacional de câncer abrangente (SSK), do centro de clínica Mayo para medicina individualizada (SSK), da Fundação Predolin (SSK), do escritório da clínica Mayo de tradução para a prática (SSK), e o programa de treinamento de cientista médico da clínica Mayo Robert L. Howell bolsa de estudos médico-cientista (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
Riferimenti
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Ricerca sul cancro. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
