Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.
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Articolo metodologico
Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T
In questo articolo
Sommario
Abstract
La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una nuova opzione di trattamento all'avanguardia e potenzialmente rivoluzionaria per il cancro. Tuttavia, ci sono limitazioni significative al suo uso diffuso nel trattamento del cancro. Queste limitazioni includono lo sviluppo di tossicità uniche come la sindrome del rilascio di citochine (CRS) e neurotossicità (NT) e l'espansione limitata, le funzioni degli efumani e l'attività anti-tumorale nei tumori solidi. Una strategia per migliorare l'efficacia car-T e/o la tossicità del controllo delle cellule CAR-T consiste nel modificare il genoma delle cellule CAR-T stesse durante la produzione di cellule CAR-T. Qui, descriviamo l'uso dell'editing del gene CRISPR/Cas9 nelle cellule CAR-T attraverso la trasduzione con un costrutto lentivirale contenente un RNA guida al granulocito macrofato fattore stimolante della colonia (GM-CSF) e Cas9. Ad esempio, descriviamo CRISPR/Cas9 mediato knockout di GM-CSF. Abbiamo dimostrato che queste cellule GM-CSFk/o CAR-T producono efficacemente meno GM-CSF, pur mantenendo la funzione critica delle cellule T e si traducono in una maggiore attività antitumorale in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico.
Introduzione
La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una grande promessa nel trattamento del cancro. 1 : il nome del , 2 Due terapie cellulari CAR-T rivolte a CD19 (CART19) sono state recentemente approvate negli Stati Uniti e in Europa per l'uso in neoplasie delle cellule B dopo aver dimostrato risultati sorprendenti negli studi clinici multicentri. 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 Le barriere all'uso più diffuso delle cellule CAR-T sono attività limitate nei tumori solidi e nelle tossicità associat....
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) di Mayo Clinic e del Institutional Biosafety Committee (IBC).
1. Produzione di cellule CART19
- Isolamento, stimolazione e cultura delle cellule T
- Eseguire tutto il lavoro di coltura cellulare in una cappa di coltura cellulare utilizzando attrezzature di protezione personale appropriate. Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) da coni di sangue normali donatori de-identificati raccolti durante l'apheresi in quanto sono noti per essere una fonte vitale di PBMC.
- Per isolare i PBMC, aggiunger....
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Risultati
La figura 1 mostra la riduzione di GM-CSF nelle celle GM-CSFk/o CART19. Per verificare che il genoma delle cellule T sia stato alterato per eliminare la GM-CSF, il sequenziamento TIDE è stato utilizzato nelle cellule GM-CSFk/o CART19 (Figura 1A). La colorazione della superficie delle cellule CAR-T verifica che le cellule T esprimano con successo il recettore della superficie CAR in vitro gating su cellule CD.......
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Discussione
In questo rapporto, descriviamo una metodologia per utilizzare la tecnologia CRISPR/Cas9 per indurre modifiche secondarie nelle cellule CAR-T. In particolare, questo è dimostrato utilizzando la trasduzione lentivirale con un vettore virale che contiene gRNA mirando al gene di interesse e Cas9 per generare cellule GM-CSFk/o CART19. In precedenza avevamo dimostrato che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 Come descritto in precedenza, le cellule .......
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Dichiarazioni
SSK è un inventore di brevetti nel campo della terapia CAR T-cell che sono autorizzati a Novartis (sotto un accordo tra Mayo Clinic, Università della Pennsylvania, e Novartis). Questi studi sono stati finanziati in parte da una sovvenzione di Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS e SSK sono inventori di brevetti relativi a questo lavoro. Il laboratorio (SSK) riceve finanziamenti da Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys e Actinium.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto attraverso sovvenzioni da K12CA090628 (SSK), la National Comprehensive Cancer Network (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), la Predolin Foundation (SSK), l'Ufficio Mayo Clinic of Translation to Practice (SSK) e il programma di formazione Per studenti della Mayo Clinic Medical Scientist Robert L. Howell Medical-Scientist Scholarship (RMS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo monoclonale CD3 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| Anticorpo monoclonale CD3 (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Sistemi di terapia cellulare) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | citometro a flusso |
| dimetil solfossido | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| soluzione salina tamponata con fosfato | di Dulbecco Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (concentratore di particelle magnetiche) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Kit di isolamento delle cellule T umane | STEMCELL Technologies | 17951 | perle magnetiche a selezione negativa; 17951RF include punte e tampone |
| Siero fetale bovino | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Topo Anti-Umano CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Terreno di fissazione (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Costrutto: Nome: CSF2 RNA guida CRISPR 1; Specie: Umana, Vettore: pLentiCRISPR v2; Resistenza: Ampicillina; Numero di copia: High; Preparazione del plasmide: Consegna standard: 4 μ g (Gratuito di carica) | GenScript | N/A ordine | personalizzato |
| Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito incrociato, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | di genetica | ||
| ; Donatori di sesso maschile; tipo AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma anticorpo monoclonale (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezione | Invitrogen | L3000075 | |
| Kit di colorazione per cellule morte Aqua fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Soluzione di Monensin, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Topo Anti-Umano CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Topo Anti-Umano CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Topo Anti-Umano MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Contenitore per congelamento Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | cellulare per leucemia linfoblastica acuta | ATCC | CRL-3273 |
| Acqua priva di nucleasi | Promega | P119C | |
| Sistemi di filtri sottovuoto Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido Nalgene con membrana CN 0,45uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I a siero ridotto Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Terreno di permeabilizzazione (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromicina dicloridrato | MP Biomedicals, Inc. | Kit di estrazione su gel 0210055210 | |
| 7144.8-16 | |||
| X-VIVO 15 Terreno a cellule ematopoietiche senza siero | Lonza | 04-418Q |
Riferimenti
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168
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