サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数
Summary
細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。
Abstract
競争力のある指標は、細菌の適合性および/またはウイルス性を評価するために使用される一般的な方法です。このアプローチの有用性は、野生型生物に多くの株の適合性を標準化するその容易さと能力によって例示される。しかし、この技術は、利用可能なプチピックマーカーと同時に評価できる株の数によって制限され、多数の反復実験の必要性を生み出す。多数の実験と並行して、フェノティピックマーカーに基づいて細菌を定量するための労力および材料コストは重要ではない。これらの負の側面を克服しつつ、細菌染色体に遺伝子マーカーをエンジニアリングした後、微生物を直接定量化する分子ベースのアプローチを開発しました。ユニークな、25塩基対DNAバーコードは、サルモネラ菌の野生型および変異株の染色体上の無害な遺伝子座に挿入された。インビトロ競技実験は、プールされた株からなるイノキュラを用いて行った。競争の後、各株の絶対数はデジタルPCRを使用して定量化され、各株の競合指数はそれらの値から計算された。我々のデータは、サルモネラ菌を定量化するこのアプローチは、非常に豊富な(高い適合性)微生物と希少な(低フィットネス)微生物の両方を検出するための非常に敏感で正確で正確であることを示しています。さらに、この技術は、改変が可能な染色体を持つほぼすべての生物や、微生物の絶対定量を必要とする様々な実験計画に容易に適応可能です。
Introduction
病原性生物の適合性とウイルス性を評価することは、微生物学研究の基本的な側面である。これは、株間または変異生物間の比較を可能にし、研究者が特定の条件下で特定の遺伝子の重要性を決定することを可能にします。伝統的に、ウイルス評価は、異なる細菌株を使用して感染の動物モデルを利用し、感染した動物の結果を観察する(例えば、感染性線量50、致死用量50、死亡時間、症状重症度、欠如症状など)。この手順は、ウイルスの貴重な説明を提供しますが、野生のタイプからの変化を検出するために結果にかなりの違いを引き起こす株が必要です。さらに、疾患の進行と症状の重症度は時間の経過とともに主観的に定量化することができるが、野生型に比べてウイルスの解釈はより質的である(すなわち、より多く、より少ない、または同様に悪性である)ので、結果は半定量的である。動物感染性アッセイを行う一般的な代替手段は、競合指数(CI)を生成する、混合感染1における野生型の対応する株の適合性またはウイルス性を直接比較する値を生成する。この技術は、野生型株に対するウイルス性を標準化し、減衰の程度を反映する定量化可能な値を決定することにより、感染の従来の動物モデルに対して多くの利点を有する。この技術はまた、取り消された競争指数(COI)2を決定することにより、細菌における遺伝子相互作用を分析するために適応することができる。変異した生物のグループのCOIを計算することで、研究者は2つの遺伝子が独立して病因に寄与しているのか、それとも同じウイルス経路に関与し、互いに依存しているのかを判断することができます。さらに、CIを計算するには、生物の病因に関する貴重な洞察を提供できる細菌の列挙が必要です。また、CIとCOIは、臨床疾患を引き起こさないが、まだフィットネスの違いを持っているアビリント株をアセスすることを可能にします。この技術は、株を同定するために従来の抗生物質耐性マーカーを使用することによって制限され、それによって入力株の数を一度に1つまたは2つだけに制限する。この制限により、大量の実験グループと反復が必要となり、人件費や材料費の増大に加えて、実験条件の変動や不正確な結果の機会も増加します。(ウイルス、フィットネス、遺伝子相互作用を研究するために混合感染症を使用することの利点とアプリケーションの徹底的なレビューについては、C.R.BeuzónとD.W.ホールデン1を参照してください)
フローサイトメトリー3、4、5を介して定量した蛍光標識細胞の使用など、この限界を克服する試みがなされている。この技術は、1)標識抗体をプノーティピックマーカーまたは2)内因性に産生した蛍光タンパク質を用いて細胞を定量する。標識抗体の使用は、1,000細胞/mLの検出の限界を有するため、3を分析するために多数の細胞を必要とする。蛍光タンパク質を発現する細胞は生理学を変化させ、高タンパク質発現に起因するフィットネス変化の影響を受けやすい6.いずれの方法も、フローサイトメトリーを用いて検出可能な蛍光マーカーの数によって制限される。分子定量の進歩は、マウスモデル7における1,000株以上の初期混合感染から120株の減衰を検出するマイクロアレイ技術の開発によって達成された。この技術は、変異株からのRNAのマイクロアレイ分析を利用し、結果にかなりのばらつきをもたらす。 それにもかかわらず、混合感染症の大きなプールは有用なツールであり、敏感な検出技術を利用することによって、細菌のウイルス性の違いを同定できることを確立しました。次世代シーケンシングの開発により、Tn-seqはトランスポゾン変異の有用性を拡大し、ランダムに変異した細菌を定量する強力な方法を可能にし、8、9、10、 11.トランスポゾンの必要性を排除し、代わりにDNAバーコードを使用してゲノムの変化とフィットネス12への影響をより簡単に特定および追跡する代替プロトコルが最近開発されました。この技術は大きな進歩ですが、ゲノムバーコードの挿入はまだランダムなプロセスです。これまでの実験のランダム性を克服するために、ユンらは細菌13の染色体上の正確な位置に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いてサルモネラ菌株のCIを計算する方法を開発した。ユニークなバーコード株は、各一意のバーコードに固有のSYBRグリーンおよびプライマーを用いたqPCRベースの方法を用いて検出された。この技術は、プライマー効率の違いや感度の低さなど、qPCRによって課される制約によって制限され、qPCRの前に入れ子になったPCRの必要性が証明された。それにもかかわらず、このアプローチは、標的ゲノム修飾が複数の細菌株のプールを検出し、潜在的に定量化するために利用できることを実証した。
以下のプロトコルでは、高感度なデジタルPCR技術を用いて正確な定量を行い、混合無分病の大きなプールで細菌競合実験を行う新しい方法論を説明する。このプロトコルは、染色体の無害な領域に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いた細菌株を遺伝的に標識することを含む。この改変により、従来のシリアル希釈、レプリカめっき、および表現力マーカーに依存するコロニー形成ユニット(すなわち抗生物質耐性)の代わりに、現代の分子技術を使用して迅速かつ正確に定量することができます。).この修飾により、単一のプールされた接種における多くの株の同時評価が可能であり、すべての株が全く同じ条件にさらされるため、実験的変動の可能性を実質的に減少させる。さらに、この技術はサルモネラ・エンテリカ・セロバー・タイフィムリウムで開発されましたが、遺伝的に可鍛性の高い生物や、正確な細菌数が必要なほぼすべての実験計画に非常に適応性が高く、新しい以前の方法によって課された制約なしで微生物学の実験室の正確さおよび効率を高めるための用具。
Protocol
Representative Results
Discussion
微生物を正確に定量化する能力は微生物学の研究にとって最も重要であり、初期混合集団からユニークな株を列挙する能力は、細菌。しかし、これを実現する技術は、分子生物学の近代的な発展に伴って進歩していません。Sを含む多くの細菌の染色体を容易に改変する技術である。Typhimuriumは、ほぼ二十年14のために利用可能であったが、この能力は、ユニークなDNA?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版物で報告された研究は、ジョージ・F・ハディックス学長の教員研究基金と国立衛生研究所(NIH)の賞番号GM103427の下で国立一般医学研究所によって支援されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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