Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле
Summary
Этот молекулярный подход для определения бактериальной пригодности облегчает точное и точное обнаружение микроорганизмов с помощью уникальных геномных штрих-кодов ДНК, которые количественно с помощью цифровых ПЦР. Протокол описывает расчет конкурентного индекса штаммов сальмонеллы; однако технология легко адаптируется к протоколам, требующим абсолютной количественной оценки любого генетически легкоподобимого организма.
Abstract
Конкурентный индекс является распространенным методом, используемым для оценки бактериальной пригодности и / или вирулентности. Полезность этого подхода иллюстрируется его легкостью выполнения и его способностью стандартизировать пригодность многих штаммов к организму дикого типа. Техника ограничена, однако, имеющимися фенотипическими маркерами и количеством штаммов, которые могут быть оценены одновременно, создавая необходимость в большом количестве повторных экспериментов. Параллельно с большим количеством экспериментов, затраты на проработку и материальные затраты на количественную оценку бактерий на основе фенотипических маркеров не являются незначительными. Чтобы преодолеть эти негативные аспекты, сохраняя при этом положительные аспекты, мы разработали молекулярный подход к непосредственной количественной оценке микроорганизмов после инженерных генетических маркеров на бактериальные хромосомы. Уникальные, 25 базовых пар ДНК штрих-коды были вставлены в безобидный локус на хромосоме дикого типа и мутант штаммов сальмонеллы. В пробирке были проведены эксперименты по проведению соревнований с использованием инокула, состоящего из объединенных штаммов. После проведения конкурса абсолютные цифры каждого штамма были количественно определены с помощью цифровых ПЦР, и из этих значений были рассчитаны конкурентоспособные индексы для каждого штамма. Наши данные показывают, что этот подход к количественной оценке сальмонеллы является чрезвычайно чувствительным, точным и точным для обнаружения как очень обильные (высокая пригодность) и редких (низкий фитнес) микроорганизмов. Кроме того, эта техника легко адаптируется практически к любому организму с хромосомами, способными к модификации, а также к различным экспериментальным конструкциям, которые требуют абсолютной количественной оценки микроорганизмов.
Introduction
Оценка пригодности и вирулентности патогенных организмов является фундаментальным аспектом микробиологических исследований. Это позволяет проводить сравнения между штаммами или между мутировавшими организмами, что позволяет исследователям определить важность определенных генов в определенных условиях. Традиционно, вирулентность оценка использует животных модель инфекции с использованием различных бактериальных штаммов и наблюдения за результатом инфицированного животного (например, инфекционная доза50, Смертельная доза50, время до смерти, тяжесть симптомов, отсутствие симптомы и т.д.). Эта процедура содержит ценные описания вирулентности, но она требует штаммов, чтобы вызвать значительные различия в результатах, с тем чтобы обнаружить отклонения от дикого типа. Кроме того, результаты являются полуколичественными, поскольку в то время как прогрессирование заболевания и тяжесть симптомов могут быть субъективно количественно с течением времени, интерпретация вирулентности по сравнению с диким типом является более качественной (т.е. больше, меньше или в равной степени вирулентным). Общей альтернативой для выполнения анализов инфекционной инфекции животных является создание конкурентоспособных индексов (CIs), значения, которые непосредственно сравнить фитнес или вирулентность штамма с диким типом аналога в смешанной инфекции1. Этот метод имеет многочисленные преимущества перед традиционной животной моделью инфекции путем стандартизации вирулентности к штамму дикого типа и определения количественной оценки, отражающей степень ослабления. Этот метод также может быть адаптирован для анализа взаимодействия генов в бактериях, определив отмененный конкурентный индекс (COI)2. Расчет COI для группы мутировавших организмов позволяет исследователям определить, независимо ли два гена способствуют патогенезу или если они участвуют в том же пути вирулентности и зависят друг от друга. Кроме того, расчет CI требует перечисления бактерий, которые могут обеспечить ценную информацию о патогенезе организмов. CIs и COIs также позволяют исследователям осла avirulent напряжения которые не причиняют клинические заболевания но все еще имеют разницы в пригодности. Этот метод ограничен использованием традиционных маркеров устойчивости к антибиотикам для выявления штаммов, тем самым ограничивая количество входных штаммов только одним или двумя за один раз. Из-за этого ограничения требуется большое количество экспериментальных групп и репликаций, что в дополнение к увеличению затрат на рабочую силу и материальные затраты, а также увеличивает возможности для изменчивости в экспериментальных условиях и неточных результатов. (Для тщательного анализа преимуществ и применений использования смешанных инфекций для изучения вирулентности, фитнеса и взаимодействия генов см. C.R. Beuzon и D.W. Holden 1)
Были предприняты попытки преодолеть это ограничение, такие как использование флуоресцентно помеченных клеток количественно через поток цитометрии3,4,5. Этот метод количественно клеток, использующих либо 1) помеченные антитела к фенотипическим маркерам или 2) эндогенно производства флуоресцентных белков. Использование помеченных антител имеет предел обнаружения 1000 клеток / мл, и поэтому требует большого количества клеток для анализа3. Клетки, выражающие флуоресцентные белки, имеют измененную физиологию ивосприимчивы к изменениям в фитнесе в результате высокой экспрессии белка 6. Оба метода ограничены количеством флуоресцентных маркеров, обнаруживаемых с помощью цитометрии потока. Прогресс в молекулярной количественной была достигнута за счет разработки метода microarray, которые обнаружили затусание в 120 штаммов от первоначальной смешанной инфекции более 1000 штаммов в модели мурин7. Этот метод использовал микроаррейный анализ РНК от мутировавших штаммов, которые приводят к значительной изменчивости в результате. Тем не менее она установила, что большие пулы смешанных инфекций могут быть полезным инструментом и что, используя чувствительные методы обнаружения, можно выявить различия в бактериальной вирулентности. С развитием последовательности следующего поколения, Tn-seq расширил полезность транспозонных мутаций, что позволило мощный метод для количественной оценки бактерий, которые были случайно мутировали8,9,10, 11. Альтернативный протокол был недавно разработан, что устраняет необходимость транспозонов и вместо этого использует ДНК штрих-коды для более легко гораздо выявления и отслеживания геномных изменений и их влияние на фитнес12. Эта технология является важным прогрессом, но вставка геномных штрих-кодов по-прежнему является случайным процессом. Чтобы преодолеть случайность предыдущих экспериментов, Yoon et al. разработали метод расчета CIs штаммов сальмонеллы с помощью уникальных штрих-кодов ДНК, вставленных в точных местах на хромосомых бактерий13. Уникальные штрих-кодированные штаммы были обнаружены с помощью метода на основе qPCR с зеленым цветом SYBR и грунтовками, специфичными для каждого уникального штрих-кода. Этот метод был ограничен ограничениями, налагаемыми qPCR, включая различия в эффективности праймера и низкую чувствительность, о чем свидетельствует необходимость вложенного ПЦР до qPCR. Тем не менее этот подход продемонстрировал, что целевые геномные изменения могут быть использованы для обнаружения и потенциально количественной оценки пулов многочисленных бактериальных штаммов.
В следующем протоколе мы описываем новую методологию для проведения экспериментов бактериальной конкуренции с большими пулами смешанных инокула, а затем точной количественной оценки с использованием высокочувствительной цифровой техники ПЦР. Протокол включает в себя генетически маркировки бактериальных штаммов с уникальным штрих-кодом ДНК вставляется на безобидной области хромосомы. Эта модификация позволяет быстро и точно количественно производить штаммы с использованием современных молекулярных технологий вместо традиционных серийных разбавлений, реплики покрытия и подсчета колоний, образующих единицы, которые полагаются на фенотипические маркеры (т.е. устойчивость к антибиотикам (т.е. устойчивость к антибиотикам ). Изменения позволяют одновременно оценивать многие штаммы в одном объединенном инокулуме, существенно уменьшая возможность экспериментальной изменчивости, поскольку все штаммы подвергаются точно таким же условиям. Кроме того, в то время как этот метод был разработан в Salmonella enterica serovar Typhimurium, он очень адаптируется к любой генетически податливый организм и почти любой экспериментальный дизайн, где точные бактериальные подсчеты необходимы, обеспечивая новый инструмент для повышения точности и пропускной их пропускной связи в микробиологических лабораториях без ограничений, налагаемых предыдущими методами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность точно количественно оценить микроорганизмы имеет первостепенное значение для исследований микробиологии, а способность перечислять уникальные штаммы из первоначальной смешанной популяции оказалась бесценным инструментом для оценки фитнеса и вирулентности в Бактерий. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, о которых сообщалось в этой публикации, были поддержаны Фондом исследований факультета Джорджа Ф. Хаддикса и Национальным институтом общей медицинской науки Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером премии GM103427. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
