عزل وتقدير كمية لفيروس زيكا من أجهزة متعددة في الماوس
Summary
والهدف من البروتوكول هو إظهار التقنيات المستخدمة للتحقيق في الأمراض الفيروسية عن طريق عزل وقياس فيروس زيكا، من أجهزة متعددة في فأر ة بعد العدوى.
Abstract
وتبين الأساليب المعروضة الإجراءات المختبرية لعزل الأعضاء عن الحيوانات المصابة بفيروس زيكا والتحديد الكمي للحمولة الفيروسية. والغرض من هذا الإجراء هو قياس التلكرات الفيروسية في المناطق الطرفية والجهاز العصبي المركزي للماوس في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى أو في ظل ظروف تجريبية مختلفة لتحديد العوامل الفيرولوجية والمناعية التي تنظم عدوى فيروس زيكا. تسمح إجراءات عزل الأعضاء التي تم إظهارها لكل من التركيز على تشكيل القياس الكمي والتقييم الكمي لـ PCR للأجهزة التيتريافية. تم تصميم تقنيات عزل الأعضاء السريعة للحفاظ على جهاز نقل الفيروس. يسمح التحديد الكمي للبنفسمن من خلال التركيز على تشكيل اختبار تقييم الإنتاجية السريع لفيروس زيكا. وفائدة التركيز على تشكيل التقييم هي تقييم الفيروس المعدي، والحد من هذا التقييم هو احتمال سمية الأعضاء مما يقلل من حد الكشف. يتم الجمع بين تقييم التتر فيروسي مع PCR الكمي، ويتم تقييم استخدام نسخة الحمض النووي الريبي المؤتلف التحكم في عدد الجينوم الفيروسي داخل الجهاز مع الحد المنخفض للكشف. عموما هذه التقنيات توفر طريقة سرعة سرعة سرعة الإنتاجية لتحليل التوتير الفيروسية زيكا في محيط والجهاز العصبي المركزي للالحيوانات المصابة بفيروس زيكا ويمكن تطبيقها على تقييم titers الفيروسية في أجهزة الحيوانات المصابة بمعظم مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس حمى الضنك.
Introduction
فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس أربو ينتمي إلى عائلة فلافيريدي، والذي يتضمن مسببات الأمراض البشرية العصبية الغازية الهامة مثل فيروس بواسان (POWV)، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV)، وفيروس غرب النيل (WNV)1. بعد عزلها وتحديدها، كانت هناك تقارير دورية عن العدوىالبشرية ZIKV في أفريقيا وآسيا 2،3،4،5،والأوبئة داخل أمريكا الوسطى والجنوبية (استعرضت في المرجع6). ومع ذلك، لم يكن حتى وقت قريب أن ZIKV كان يعتقد أن يسبب مرض شديد7. الآن هناك الآلاف من حالات الأمراض العصبية والعيوب الخلقية المرتبطة بعدوى ZIKV. وقد أثار الظهور السريع لـ ZIKV العديد من الأسئلة المتعلقة بما يلي: لماذا هناك زيادة في شدة المرض، وما هي الاستجابة المناعية للعدوى ZIKV، وهناك أمراض فيروسية و/أو مناعية مرتبطة بزيادة في العصبية المظاهر والعيوب الخلقية. هناك الآن الاندفاع لفهم الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض ذات الصلة المرتبطة ZIKV، فضلا عن الحاجة إلى اختبار سريع لفعالية مضادات الفيروسات واللقاحات ضد ZIKV. وفي ظل هذه الخلفية، قمنا بتطوير أساليب للتحليل السريع لأجهزة التتيكون ZIKV في كل من المحيط والجهاز العصبي الكندي باستخدام تركيز خاص بـ ZIKV يشكل اختبارًا (FFA).
النماذج الحيوانية الصغيرة مهمة لفهم تطور المرض وللتقييم المبكر لللقاحات والعلاج ومضادات الفيروسات. لقد أنشأنا نماذج حيوانية صغيرة لدراسة مرض arbovirus باستخدام سلالات الماوس المختلفة لنموذج العدوى البشرية والحماية من مسببات الأمراض الفيروسية8،9،10،11، 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21،22. باستخدام هذه التجربة السابقة، بدأنا في تعديل التقنيات المستخدمة لتقييم فيروس WNV وحمى الضنك، وهو فيروس فلافي ذات الصلة لتقييم تيتر ZIKV في كل من الأجهزة الطرفية، فضلا عن الجهاز العصبي المركزي21،23، 24– ومزايا هذه الأساليب على الاختبارات الأخرى هي: (1) أنها تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء لأغراض التحليل؛ (2) أن هذه الأساليب تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء من أجل التحليل؛ (2) أن هذه الأساليب تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء من أجل التحليل. 2) الطرق قابلة للتكيف لتدفق قياس الخلايا، لقياسات الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، جنبا إلى جنب مع titers الفيروسية على نفس الحيوان في نفس الجهاز؛ 3) تقنية الحصاد قابلة للتكيف للتحليل النسيجي؛ 4) وFFA ZIKV هو طريقة سرعة الإنتاجية عالية لتحليل التتر الفيروسية؛ و5) يمكن تطبيق هذه الأساليب على تقييم التيتفيات الفيروسية في أجهزة الحيوانات المصابة بمعظم مسببات الأمراض25.
Protocol
Representative Results
Discussion
عدوى ZIKV يمكن أن يسبب مرض عصبي وبالتالي فإن النماذج الحيوانية الحالية لدراسة مسببات الأمراض، والاستجابات المناعية والفعالية الوقائية من اللقاحات ومضادات الفيروسات تحتاج إلى التركيز على السيطرة الفيروسية داخل الجهاز العصبي الوطني. أحد التحديات في التركيز على مرض الجهاز العصبي المركزي ه?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل الدكتور بينتو من منحة البذور من كلية الطب بجامعة سانت لويس وصناديق بدء التشغيل من كلية الطب بجامعة سانت لويس. يتم تمويل الدكتور برين من قبل K22AI104794 جائزة المحقق المبكر من NIAID NIH، فضلا عن منحة البذور من مدرسة جامعة سانت لويس. وبالنسبة لجميع الأفراد الممولين، لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو اتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو إعدادها.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Riferimenti
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
