Isolering og kvantificering af Zikavirus fra flere organer i en mus
Summary
Målet med protokollen er at demonstrere de teknikker, der anvendes til at undersøge virussygdom ved at isolere og kvantificere Zikavirus, fra flere organer i en mus efter infektion.
Abstract
De metoder, der fremlægges, viser laboratorieprocedurer for isolering af organer fra Zikavirus inficerede dyr og kvantificering af virusbelastningen. Formålet med proceduren er at kvantificere virale titre i perifere og CNS-områder af musen på forskellige tidspunkter efter infektion eller under forskellige eksperimentelle betingelser for at identificere virologiske og immunologiske faktorer, der regulerer Zikavirus infektion. De viste organ isolations procedurer muliggør både kvantificering af fokus dannelse og kvantitativ PCR-vurdering af virale titre. De hurtige organ isolering teknikker er designet til bevarelse af virus titer. Viral titer kvantificering af fokus danner assay giver mulighed for hurtig gennemstrømning vurdering af Zikavirus. Fordelen ved den fokus dannende analyse er vurderingen af infektiøs virus, begrænsningen af denne analyse er potentialet for organtoksicitet, der nedsætter detektionsgrænsen. Viral titer vurdering kombineres med kvantitativ PCR, og ved hjælp af en rekombinant RNA kopi kontrol viral genom kopi nummer i organet er vurderet med lav detektionsgrænse. Samlet set giver disse teknikker en nøjagtig hurtig høj gennemløbs metode til analyse af zikaviviral titre i periferien og CNS hos zikavirus inficerede dyr og kan anvendes til vurdering af virale titre i organerne hos dyr, der er inficeret med de fleste patogener, herunder Denguevirus.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en arbovirus, der tilhører Flaviviridae familien, som omfatter vigtige Neuroinvasive humane patogener såsom Powassan virus (POWV), japansk encephalitis virus (JEV), og West Nile virus (WNV)1. Efter isolering og identifikation har der været periodiske rapporter om humane zikv-infektioner i Afrika og Asien2,3,4,5og epidemier i Central-og Sydamerika (gennemgået i reference6). Men, det var først for nylig, at ZIKV blev anset for at forårsage svær sygdom7. Nu er der tusindvis af tilfælde af neurologiske sygdomme og fødselsdefekter forbundet med ZIKV infektioner. Den hurtige opståen af ZIKV har foranlediget mange spørgsmål vedrørende: hvorfor der er en stigning i sygdommens sværhedsgrad, hvad er den immunologiske reaktion på ZIKV infektion og er der virale og/eller immunmedierede patologier forbundet med stigningen i neurologiske manifestationer og fødselsdefekter. Der er nu et kapløb om at forstå det centrale nervesystem (CNS) relaterede sygdom forbundet med ZIKV samt behovet for hurtigt at teste effekten af antivirale lægemidler og vacciner mod ZIKV. Det er på denne baggrund, at vi har udviklet metoder til hurtig analyse af ZIKV titre i både periferien og CNS ved hjælp af en ZIKV-specifikke fokus danner assays (FFA).
Små dyremodeller er vigtige for at forstå sygdomsprogression og for tidlig evaluering af vacciner, terapi og antivirale lægemidler. Vi har etableret små dyremodeller til studiet af arbovirus sygdom ved hjælp af forskellige muse stammer til at modellere menneskelig infektion og beskyttelse mod virale patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Ved hjælp af denne tidligere erfaring, vi begyndte at ændre teknikker, der anvendes til vurdering af wnv og dengue virus, en beslægtet flavivirus til vurdering af zikv titer i begge perifere organer samt CNS21,23, 24. fordelene ved disse metoder frem for andre assays er: 1) at de kombinerer evnen til at høste både perifere og CNS organer til analysen; 2) metoderne er tilpasningsdygtige for strømnings cytometri, for målinger af medfødte og adaptive immunrespons, sammen med virale titre på samme dyr i samme organ; 3) høst teknikken er tilpasningsdygtig til histologisk analyse; 4) ZIKV FFA er en hurtig høj gennemløb metode til viral titer analyse; og 5) disse metoder kan anvendes til vurdering af viral titre i organerne af dyr inficeret med de fleste patogener25.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV infektion kan forårsage en neurologisk sygdom derfor de nuværende dyremodeller til at studere patogenesen, immunrespons og beskyttende effekt af vacciner og antivirale lægemidler skal fokusere på viral kontrol inden for CNS. En af udfordringerne i at fokusere på CNS sygdom er, at det ofte kommer på bekostning af at studere perifer infektion. De organ isolations metoder, der foreslås her, fokuserer på behovet for hurtigt at evaluere ZIKV-infektion i både periferien og CNS med henblik på at vurdere CNS-medie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pinto er finansieret af et frø tilskud fra Saint Louis University School of Medicine og Startup midler fra Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien er finansieret af en K22AI104794 tidlig investigator Award fra NIH NIAID samt et frø Grant fra Saint Louis University School. For alle finansierede individer havde finansieringskilderne ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om offentliggørelse eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Riferimenti
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
