Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus
Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.
Abstract
Die vorgestellten Methoden zeigen Laborverfahren zur Isolierung von Organen von mit dem Zika-Virus infizierten Tieren und zur Quantifizierung der Viruslast. Der Zweck des Verfahrens ist es, virale Titter in peripheren und ZNS-Bereichen der Maus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu quantifizieren, um virologische und immunologische Faktoren zu identifizieren, die die Zika-Virusinfektion regulieren. Die gezeigten Organisolationsverfahren ermöglichen sowohl die Fokusbildung der Assay-Quantifizierung als auch die quantitative PCR-Bewertung von viralen Titern. Die schnellen Organisolationstechniken sind für die Erhaltung von Virustiter konzipiert. Die virale Titerquantifizierung durch Fokusbildenden Assay ermöglicht eine schnelle Durchsatzbewertung des Zika-Virus. Der Vorteil des Fokus bildenden Assays ist die Bewertung von infektiösen Viren, die Einschränkung dieses Assays ist das Potenzial für Organtoxizität, die die Nachweisgrenze reduziert. Virale Titer-Bewertung wird mit quantitativer PCR kombiniert, und mit einer rekombinanten RNA-Kopierkontrolle wird die virale Genomkopie-Kopiennummer innerhalb des Organs mit geringer Nachweisgrenze bewertet. Insgesamt bieten diese Techniken eine genaue schnelle Hochdurchsatzmethode für die Analyse von Zika-Virustittern in der Peripherie und ZNS von Zika-Virus infizierten Tieren und können auf die Beurteilung von viralen Tittern in den Organen von Tieren angewendet werden, die mit den meisten Infizierten infiziert sind. Krankheitserreger, einschließlich Dengue-Virus.
Introduction
Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein Arbovirus, das zur Familie der Flaviviridae gehört und wichtige neuroinvasive menschliche Krankheitserreger wie das Powassan-Virus (POWV), das japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das West-Nil-Virus (WNV)1umfasst. Nach seiner Isolierung und Identifizierung gab es regelmäßig Berichte über humane ZIKV-Infektionen in Afrika und Asien2,3,4,5und Epidemien in Mittel- und Südamerika (überprüft in Referenz6). Jedoch, Es war nicht bis vor kurzem, dass ZIKV gedacht wurde, um schwere Krankheit verursachen7. Jetzt gibt es Tausende von Fällen von neurologischen Erkrankungen und Geburtsfehlern im Zusammenhang mit ZIKV-Infektionen. Das schnelle Aufkommen von ZIKV hat viele Fragen im Zusammenhang mit: Warum gibt es eine Zunahme der Krankheit schwere, was ist die immunologische Reaktion auf ZIKV-Infektion und gibt es virale und / oder Immun vermittelten Pathologien mit der Zunahme der neurologischen Manifestationen und Geburtsfehler. Es gibt jetzt eine Eile, um die mit ZIKV verbundene Erkrankung des zentralbedingten Nervensystems (ZNS) zu verstehen sowie die Notwendigkeit, die Wirksamkeit der antiviralen Medikamente und Impfstoffe gegen ZIKV schnell zu testen. Vor diesem Hintergrund haben wir Methoden zur schnellen Analyse von ZIKV-Tistern sowohl in der Peripherie als auch in der ZNS mit hilfe eines ZIKV-spezifischen Fokusbildungs-Assays (FFA) entwickelt.
Kleintiermodelle sind wichtig für das Verständnis des Krankheitsverlaufs und für die frühzeitige Bewertung von Impfstoffen, Therapeutika und Antiviralen. Wir haben Kleintiermodelle für die Untersuchung von Arbovirus-Erkrankungen etabliert, indem wir verschiedene Mausstämme verwenden, um menschliche Infektionen und Schutz vor viralen Krankheitserregernzumodellieren 8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Mit Diesen früheren Erfahrungen begannen wir, Techniken zur Bewertung des WNV- und Dengue-Virus, eines verwandten Flavivirus zur Beurteilung von ZIKV-Titer in beiden peripheren Organen sowie des CNS21,23, zu modifizieren. 24. Die Vorteile dieser Methoden gegenüber anderen Assays sind: 1) dass sie die Fähigkeit kombinieren, sowohl periphere als auch ZNS-Organe für die Analyse zu ernten; 2) die Methoden sind anpassungsfähig für die Durchflusszytometrie, für Messungen angeborener und adaptiver Immunantworten, zusammen mit viralen Tittern an demselben Tier im selben Organ; 3) die Erntetechnik ist für die histologische Analyse anpassungsfähig; 4) die ZIKV FFA ist eine schnelle Hochdurchsatzmethode für die virale Titeranalyse; und 5) diese Methoden können auf die Beurteilung von Virustorten in den Organen von Tieren angewendet werden, die mit den meisten Krankheitserregern infiziert sind25.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZikV-Infektion kann eine neurologische Erkrankung verursachen, daher müssen die aktuellen Tiermodelle, um Pathogenese, Immunantworten und schützende Wirksamkeit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten zu untersuchen, sich auf die Viruskontrolle innerhalb des ZNS konzentrieren. Eine der Herausforderungen bei der Konzentration auf ZNS-Krankheit ist, dass es oft auf Kosten der Untersuchung peripherer Infektionen kommt. Die hier vorgeschlagenen Methoden der Organisolierung konzentrieren sich auf die Notwendigkeit, die…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pinto wird durch ein Saatgutstipendium der Saint Louis University School of Medicine und Start-up-Fonds von der Saint Louis University School of Medicine finanziert. Dr. Brien wird durch einen K22AI104794 Early Investigator Award des NIH NIAID sowie ein Saatgutstipendium der Saint Louis University School finanziert. Für alle geförderten Personen spielten die Geldgeber keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Riferimenti
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
