एक माउस में एकाधिक अंगों से ज़िका वायरस का अलगाव और परिमाणीकरण
Summary
प्रोटोकॉल का लक्ष्य संक्रमण के बाद एक माउस में कई अंगों से, जिका वायरस को अलग और परिमाणित करके वायरल रोग की जांच करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों का प्रदर्शन करना है।
Abstract
प्रस्तुत किए जा रहे तरीकों से जिका वायरस संक्रमित जानवरों से अंगों के अलगाव और वायरल लोड के परिमाणीकरण के लिए प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का प्रदर्शन होता है। प्रक्रिया का उद्देश्य अलग-अलग समय बिंदुओं पर संक्रमण के बाद या विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में माउस के परिधीय और सीएनएस क्षेत्रों में वायरल titers मात्रा निर्धारित करने के लिए virologic और प्रतिरक्षा कारकों है कि जिका वायरस संक्रमण को विनियमित की पहचान करने के लिए है। अंग अलगाव प्रक्रियाओं का प्रदर्शन दोनों फोकस बनाने परख परिमाणीकरण और वायरल titers के मात्रात्मक पीसीआर मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं. तेजी से अंग अलगाव तकनीक वायरस titer के संरक्षण के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. फोकस बनाने परख द्वारा वायरल titer परिमाणीकरण जिका वायरस के तेजी से थ्रूपुट मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. फोकस बनाने परख का लाभ संक्रामक वायरस का आकलन है, इस परख की सीमा अंग विषाक्तता का पता लगाने की सीमा को कम करने के लिए क्षमता है. वायरल titer मूल्यांकन मात्रात्मक पीसीआर के साथ संयुक्त है, और अंग के भीतर एक पुनः संयोजक आरएनए प्रतिलिपि नियंत्रण वायरल जीनोम प्रतिलिपि संख्या का उपयोग कर पता लगाने की कम सीमा के साथ मूल्यांकन किया है. कुल मिलाकर इन तकनीकों की परिधि और जिका वायरस संक्रमित जानवरों के सीएनएस में जिका वायरल titers के विश्लेषण के लिए एक सटीक तेजी से उच्च थ्रूपुट विधि प्रदान करते हैं और सबसे से संक्रमित जानवरों के अंगों में वायरल titers के आकलन के लिए लागू किया जा सकता है डेंगू वायरस सहित रोगजनक।
Introduction
जिका वायरस (ज़िकवी) एक आर्बोवायरस है जो फ्लेविरिडी परिवार से संबंधित है, जिसमें महत्वपूर्ण न्यूरोसिव मानव रोगजनक जैसे पोवासन वायरस (पीओडब्ल्यूवी), जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी), और वेस्ट नील नील वायरस (डब्ल्यूएनवी)1शामिल हैं। इसके अलगाव और पहचान के बाद, अफ्रीका और एशिया2,3,4,5, और मध्य और दक्षिण अमेरिका के भीतर महामारियों में मानव $IKV संक्रमण की आवधिक रिपोर्ट किया गया है (में समीक्षा की संदर्भ6). हालांकि, यह हाल तक नहीं था कि ]iKV गंभीर बीमारी7पैदा करने के लिए सोचा गया था. अब स्नायविक रोग और जन्म दोष के हजारों मामले हैं जो कि जेडआईकेवी संक्रमण से जुड़े हुए हैं। जेडआईकेवी के तेजी से उभरने से संबंधित कई सवाल पूछे गए हैं: रोग की गंभीरता में वृद्धि क्यों हुई है, जेडआईकेवी संक्रमण के प्रतिप्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया क्या है और वहाँ वायरल और/या प्रतिरक्षा मध्यस्थता रोग हैं जो तंत्रिका विज्ञान में वृद्धि से जुड़े हुए हैं अभिव्यक्तियों और जन्म दोष. अब केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से संबंधित बीमारी को समझने के साथ-साथ जेडआईकेवी के खिलाफ एंटीवायरल और टीकों की प्रभावकारिता का तेजी से परीक्षण करने की आवश्यकता है। यह इस पृष्ठभूमि के खिलाफ है कि हमने जेडआईवी टिटरों के तीव्र विश्लेषण के लिए दोनों परिधि और सीएनएस में एक जेडआईकेवी-विशिष्ट फोकस फोकस (एफएफए) का उपयोग करके तरीके विकसित किए हैं।
छोटे पशु मॉडल रोग प्रगति को समझने के लिए और टीकों, चिकित्सकीय, और विरोधी वायरल के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमने मानव संक्रमण और वायरल रोगजनकों के विरुद्ध सुरक्षा के मॉडल के लिए विभिन्नमाउस उपभेदों का उपयोग करके आर्बोवायरस रोग के अध्ययन के लिए छोटे पशु मॉडल स्थापित किए हैं, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. इस पूर्व अनुभव का उपयोग करते हुए, हम WNV और डेंगू वायरस, दोनों परिधीय अंगों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीएनएस21,23में जेडआईकेवी टिटर के आकलन के लिए एक संबंधित flavivirus के आकलन के लिए इस्तेमाल किया तकनीकको संशोधित करने के लिए शुरू किया, 24.अन्य परख की जाती है पर इन विधियों के फायदे हैं: 1) कि वे विश्लेषण के लिए परिधीय और सीएनएस दोनों अंगों को फसल की क्षमता को जोड़ते हैं; 2) तरीकों प्रवाह साइटोमेट्री के लिए अनुकूली हैं, सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की माप के लिए, एक ही अंग में एक ही जानवर पर वायरल titers के साथ; 3) फसल तकनीक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय है; 4) जेडआईकेवी एफएफए वायरल टिटर विश्लेषण के लिए एक तेजी से उच्च थ्रूपुट विधि है; और 5) इन विधियों को अधिकांश रोगजनकों से संक्रमित जानवरों के अंगों में वायरल titers के आकलन के लिए लागू किया जा सकता है25.
Protocol
Representative Results
Discussion
जेडआईकेवी संक्रमण एक न्यूरोलॉजिकल बीमारी का कारण बन सकता है इसलिए वर्तमान पशु मॉडल रोगजनन का अध्ययन करने के लिए, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और टीकों और एंटीवायरल की सुरक्षात्मक प्रभावकारिता सीएनएस क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ पिंटो चिकित्सा के सेंट लुइस विश्वविद्यालय स्कूल और सेंट लुइस विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन से स्टार्टअप धन से एक बीज अनुदान द्वारा वित्त पोषित है। डॉ Brien NIH NIAID से एक K22AI104794 जल्दी अन्वेषक पुरस्कार के रूप में अच्छी तरह से सेंट लुइस विश्वविद्यालय स्कूल से एक बीज अनुदान द्वारा वित्त पोषित है. सभी वित्त पोषित व्यक्तियों के लिए funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Riferimenti
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