Isolering og kvantifisering av Zika virus fra flere organer i en mus
Summary
Målet med protokollen er å demonstrere teknikker som brukes til å undersøke viral sykdom ved å isolere og kvantifisere Zika virus, fra flere organer i en mus etter infeksjon.
Abstract
Metodene blir presentert demonstrere laboratorie prosedyrer for isolering av organer fra Zika virusinfiserte dyr og kvantifisering av viral belastning. Formålet med prosedyren er å kvantifisere viral titers i perifere og CNS områder av musen på ulike tidspunkt poeng etter smitte eller under ulike eksperimentelle forhold for å identifisere virologisk og immunologiske faktorer som regulerer Zika virus infeksjon. Organ isolasjons prosedyrene viste gir mulighet for både fokus forming av analyse kvantifisering og kvantitativ PCR-vurdering av viral titers. De raske organ isolasjons teknikkene er utviklet for å bevare virus titer. Viral titer kvantifisering av fokus forming analysen gjør det mulig for rask gjennomstrømming vurdering av Zika virus. Fordelen med fokus forming analysen er vurderingen av smittsomme virus, er begrensningen av denne analysen potensialet for organ toksisitet redusere grensen for deteksjon. Viral titer vurdering er kombinert med kvantitativ PCR, og ved hjelp av et rekombinant RNA kopi kontroll viral Genova kopi nummer innenfor orgelet er vurdert med lav grense for påvisning. Samlet disse teknikkene gir en nøyaktig rask høy gjennomstrømning metode for analyse av Zika viral titers i periferien og CNS av Zika virusinfiserte dyr og kan brukes til vurdering av viral titers i organer av dyr smittet med de fleste patogener, inkludert Dengue virus.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en arbovirus som tilhører den hvilken familien, som inkluderer viktige neuroinvasive menneskelige patogener som Woodstock virus (POWV), japansk encefalitt virus (JEV), og West Nile virus (WNV)1. Etter sin isolasjon og identifisering, har det vært periodiske rapporter om menneskelige ZIKV infeksjoner i Afrika og Asia2,3,4,5, og epidemier i Sentral-og Sør-Amerika (omtalt i Referanse6). Men det var ikke før nylig at ZIKV ble antatt å forårsake alvorlig sykdom7. Nå er det tusenvis av tilfeller av nevrologiske sykdommer og fødselsskader knyttet til ZIKV infeksjoner. Den raske fremveksten av ZIKV har bedt om mange spørsmål knyttet til: hvorfor det er en økning i sykdoms alvorlighetsgrad, hva er det immunologiske svaret på ZIKV infeksjon og er det viral og/eller immune mediert patologi knyttet til økningen i nevrologiske manifestasjoner og fødselsskader. Det er nå et rush å forstå sentralnervesystemet (CNS) relatert sykdom forbundet med ZIKV samt behovet for å raskt teste effekten av antivirale midler og vaksiner mot ZIKV. Det er mot denne bakgrunnen at vi har utviklet metoder for rask analyse av ZIKV titers i både periferien og CNS ved hjelp av en ZIKV-spesifikk fokus forming analyser (FFA).
Små dyremodeller er viktige for å forstå sykdomsprogresjon og for tidlig evaluering av vaksiner, legemiddel, og anti-Virals. Vi har etablert små dyremodeller for studiet av arbovirus sykdom ved hjelp av ulike mus belastninger for å modellere menneskelig infeksjon og beskyttelse mot viral patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Ved hjelp av denne tidligere erfaring, begynte vi å endre teknikker som brukes for vurdering av WNV og Dengue virus, en relatert Flavivirus for vurdering av ZIKV titer i både perifere organer, samt CNS21,23, 24. fordelene med disse metodene fremfor andre analyser er: 1) at de kombinerer evnen til å høste både PERIFERE og CNS organer for analysen; 2) metodene er tilpasningsdyktige for Flow flowcytometri, for målinger av medfødte og adaptive immunresponser, sammen med viral titers på samme dyret i samme organ; 3) innhøstingen teknikken er tilpasningsdyktig for histologiske analyse; 4) ZIKV FFA er en rask høy gjennomstrømning metode for viral titer analyse; og 5) disse metodene kan brukes til vurdering av viral titers i organer av dyr smittet med de fleste patogener25.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV infeksjon kan føre til en nevrologisk sykdom derfor gjeldende dyremodeller å studere patogenesen, immunresponser og beskyttende effekt av vaksiner og antivirale midler må fokusere på viral kontroll i CNS. En av utfordringene med å fokusere på CNS sykdom er at det ofte kommer på bekostning av å studere perifer infeksjon. Orgelet isolasjon metoder foreslått her fokuserer på behovet for å raskt evaluere ZIKV infeksjon i både periferien og CNS for å vurdere CNS mediert ZIKV assosiert sykdom og etablere en m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pinto er finansiert av et frø stipend fra Saint Louis University School of Medicine og oppstart midler fra Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien er finansiert av en K22AI104794 tidlig etterforsker Award fra NIH NIAID samt et frø stipend fra Saint Louis University School. For alle finansierte individer hadde Oppdragsgivers ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Riferimenti
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
