Isolering och kvantifiering av zikavirus från flera organ i en mus
Summary
Målet med protokollet är att demonstrera de tekniker som används för att undersöka virussjukdom genom att isolera och kvantifiera zikaviruset, från flera organ i en mus efter infektion.
Abstract
De metoder som presenteras visar laboratorie procedurer för isolering av organ från Zikavirusinfekterade djur och kvantifiering av virusbelastningen. Syftet med förfarandet är att kvantifiera virala titrar i perifera och CNS områden av musen vid olika tidpunkter efter infektion eller under olika experimentella förhållanden för att identifiera virologiska och immunologiska faktorer som reglerar zikavirus infektion. De organ isolerings procedurer som påvisats möjliggör både kvantifiering av fokus formning och kvantitativ PCR-bedömning av virala titrar. Teknikerna för snabb organ isolering är utformade för att bevara virus titer. Viral titer kvantifiering genom fokus formning assay möjliggör snabb genomströmning bedömning av zika virus. Fördelen med fokus bildar analysen är bedömningen av smittsamma virus, begränsningen av denna analys är potentialen för organtoxicitet minska detektionsgränsen. Viral titer-bedömning kombineras med kvantitativ PCR, och med hjälp av ett rekombinant RNA Copy-kontroll virus arvs kopienummer inom orgeln bedöms med låg detektionsgräns. Sammantaget ger dessa tekniker en exakt snabb, hög genomflödesteknik för analys av zikaviruxtitrar i periferin och CNS hos zika-virusinfekterade djur och kan appliceras på bedömningen av virala titrar i organen hos djur som infekterats med de flesta patogener, inklusive denguevirus.
Introduction
Zika virus (ZIKV) är ett arbovirus som tillhör familjen Flaviviridae, som innehåller viktiga neuroinvasiva humana patogener såsom Powassan virus (POWV), japanskt encefalit virus (JEV), och West Nile virus (WNV)1. Efter dess isolering och identifiering har det förekommit periodiska rapporter om humana zikv-infektioner i Afrika och Asien2,3,4,5och epidemier inom Central-och Sydamerika (ses över i referens6). Det var dock inte förrän nyligen som ZIKV ansågs orsaka allvarlig sjukdom7. Nu finns det tusentals fall av neurologiska sjukdomar och fosterskador kopplade till ZIKV infektioner. Den snabba uppkomsten av ZIKV har föranlett många frågor om: varför det finns en ökning av sjukdomens svårighetsgrad, vad är det immunologiska svaret på ZIKV-infektion och finns det virala och/eller immunmedierade patologier kopplade till ökningen av neurologiska manifestationer och fosterskador. Det finns nu bråttom att förstå den centralanervsystemet (CNS) relaterade sjukdom i samband med ZIKV samt behovet av att snabbt testa effekten av antivirala läkemedel och vacciner mot ZIKV. Det är mot denna bakgrund som vi har utvecklat metoder för snabb analys av ZIKV-titrar i både periferi och CNS med hjälp av en ZIKV-specifika fokus bildar analyser (FFA).
Små djurmodeller är viktiga för att förstå sjukdomsprogression och för tidig utvärdering av vacciner, Therapeutics och antivirala läkemedel. Vi har etablerat små djurmodeller för studiet av arbovirus sjukdom genom att använda olika mus stammar för att modellera mänsklig infektion och skydd mot virala patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Med denna tidigare erfarenhet började vi ändra tekniker som används för bedömning av wNv och Dengue virus, ett relaterat och för bedömning av zikv titer i både perifera organ samt CNS21,23, 24. fördelarna med dessa metoder framför andra analyser är: 1) att de kombinerar förmågan att skörda både PERIFERA och CNS-organ för analys; 2) metoderna är anpassningsbara för flödescytometri, för mätningar av medfödda och adaptiva immunsvar, tillsammans med virala titrar på samma djur i samma organ; 3) skörde tekniken är anpassningsbar för histologisk analys; 4) den ZIKV FFA är en snabb hög genomströmning metod för viral titer analys; och 5) dessa metoder kan tillämpas för bedömning av virala titrar i organ av djur infekterade med de flesta patogener25.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV-infektion kan orsaka en neurologisk sjukdom därför den nuvarande djurmodeller för att studera patogenes, immunsvar och skyddande effekt av vacciner och antivirala läkemedel måste fokusera på viral kontroll inom CNS. En av utmaningarna med att fokusera på CNS-sjukdom är att det ofta kommer på bekostnad av att studera perifer infektion. De organ isoleringsmetoder som föreslås här fokuserar på behovet av att snabbt utvärdera ZIKV infektion i både periferin och CNS för att bedöma CNS-medierad ZIKV assoc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Pinto finansieras av ett frö bidrag från Saint Louis University School of Medicine och Startup medel från Saint Louis University School of Medicine. Dr Brien finansieras av en K22AI104794 Early Investigator Award från NIH NIAID samt ett frö bidrag från Saint Louis University School. För alla finansierade individer hade finansiärer ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Riferimenti
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
