여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.
생물학의 근본적인 목표는 개발 중에 패턴이 어떻게 나타나는지 이해하는 것입니다. 몇몇 단은 줄기 세포가 공간적으로 마이크로 패턴에 국한될 때 시험관에서 패터닝이 달성될 수 있다는 것을 보여주었습니다, 따라서 생물학의 근본적인 원리를, 시험관에서, 확인하는 유일한 기회를 제안하는 실험적인 모형을 설치합니다 조직.
여기서는 방법론에 대한 자체 구현에 대해 설명합니다. 우리는 표준 세포 생물학 실험실에서 방법을 쉽게 확립 할 수 있도록 특수 장비의 필요성을 줄이기 위해 사진 패터닝 기술을 적용했습니다. 우리는 또한 표준 모양과 크기의 식민지 내에서 세포의 하위 집단의 우대 위치를 정확하게 측정하기 위해 무료 오픈 소스 및 설치하기 쉬운 이미지 분석 프레임 워크를 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 겉보기에 무질서한 세포 집단에서도 패터닝 이벤트의 존재를 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 정량적 통찰력을 제공하며 주어진 패터닝 프로세스에서 환경의 영향(예: 물리적 단서 또는 내인성 신호)을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.
포유류 시스템에서, 패터닝은 세포의 집단 행동의 출현 특성이므로, 적절한 단서가 세포 1,2,3,4에제공되면 패턴이 시험관 내에서 형성 될 수있습니다. 5개 , 6. 시험관 내에서 자가 구성하는 세포의 본질적인 능력을 드러내는 한 가지 방법은 세포가 정의 된 모양과크기의 그룹 / 식민지를 형성하도록 강요하는 것입니다 7,8,9,10 . 이를 가능하게 하는 기술은 마이크로패킹11이다. 마이크로 패터닝을 통해 세포외 매트릭스(ECM) 분자가 표면에 증착되는 위치를 정확하게 정의할 수 있습니다. 이것은, 차례차례로 세포가 밀착할 수 있는 곳에 지시하고 그러므로 세포가 공간적으로 구성하는 방법을 통제합니다.
마이크로 패터닝은 다양한 응용 분야, 예를 들어, 마이크로 패터닝을 통해 분화12전에 초기 조건의 표준화를 가능하게 하는 기술이다. 중요한 것은, 마이크로 패터닝은 세포 콜로니의 크기, 모양 및 간격을 쉽게 제어 할 수 있게 하며,이 속성은 모르포겐 또는 물리적 단서에 대한 세포의 집단 반응을 심문하기위한 실험을 고안하는 데 사용할 수 있습니다7 , 8개 , 10개 , 13세 , 14세 , 15세 , 16세 , 17.
몇 가지 마이크로 패터닝 방법이 개발되었습니다11. 포토 패킹 기술은 아마도18을설정하는 가장 쉬운 방법입니다. 이들 접근법은 또한 단일 세포18,19,20의형상을 제어하는데 사용될 수 있기 때문에 정밀도의 장점을 갖는다. 그러나, 그들은 또한 표준 생물학 실험실에서 일반적으로 쉽게 사용할 수없는 스핀 코터, 플라즈마 챔버 및 UVO (UV-오존) 클리너를 포함한 고가의 특수 장비를 필요로합니다. 이 기술의 채택을 용이하게 하기 위해, 우리는 UVO 램프만을 필요로 하는 프로토콜을 적용했습니다. 우리는 가위로 또는 원하는 형식으로 구멍 펀치로 절단 할 수있는 상업적으로 사용할 수있는 플라스틱 슬라이드에서 시작합니다.
마이크로 패턴의 한 가지 중요한 유틸리티는 여러 복제에 걸쳐 개별 식민지를 비교하기 위해 식민지를 표준화하는 기능입니다. 이를 통해 이러한 식민지 내의 패턴 형성이 어느 정도까지 재현 가능한지 물어보고 패터닝 프로세스의 견고성에 영향을 미치는 요인을 탐색할 수 있습니다. 중요한 것은, 여러 표준화 된 식민지에 걸쳐 “평균”패턴의 정량화는 그렇지 않으면 명백하지 않을 패터닝 프로세스를 나타낼 수 있습니다. 표준화된 식민지에서 패터닝을 정량화할 수 있다는 장점은 단일 세포 수준에서 단백질 발현을 정확하게 측정할 수 있다는 점에 달려 있습니다. 그러나 마이크로 패턴의 셀은 종종 단단히 포장되어 높은 정확도로 분류하기가 어렵습니다. 세포는 또한 종종 2차원이 아닌 3차원으로 구성되며, 세분화 하는 동안 3차원(3D) 정보를 감지하고 보존하는 것이 어려울 수 있습니다. 셀이 성공적으로 분할되면 결과 데이터 집합에서 패터닝 정보를 추출하는 데 계산 방법이 필요합니다.
우리는 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 되는 세분화 및 이미지 분석 도구를 개발했습니다. 이 분석 방법은 무료 및 오픈 소스 소프트웨어만 사용하며 구현하기 위해 명령줄이나 프로그래밍에 대한 지식이 필요하지 않습니다. 여기서 방법을 설명하기 위해, 우리는 초기 분화 brachyury (Tbra)21,22의마커를 자발적으로 발현하는 마우스 배아 줄기 (mES) 세포를 사용한다. 명백한 공간 배열은 시각적으로 감지할 수 없지만 이 방법을 사용하면 식민지에서 T+ 셀의 우선 위치 맵을 만들 수 있습니다. 우리는 또한 Tbra 패터닝이 Id1을 발현하는 세포의 우대 국소화의 부재와 대조되는 것을 보여 주며, 골형태유전학적 단백질(BMP) 경로(23)의 직접적인 판독을 보여준다. 또한 이 방법의 현재 한계와 이 기술이 다른 실험 시스템에 어떻게 적용될 수 있는지에 대해서도 논의합니다.
여기에서 우리는 세포의 배양에서 출현 패터닝을 분석하는 방법을 기술한다. 단순화된 마이크로패터닝 접근법은 세포 콜로니의 모양과 크기를 표준화하는 데 사용되며, 이러한 콜로니 내에서 패턴을 감지하고 정량화할 수 있는 이미지 분석 도구와 R 스크립트를 제공합니다.
우리가 제안하는 파이프라인은 저자가 상업적으로 이용 가능한 마이크로 패턴을 사용하여 ESC 식민지에서 재현 가능한 세균 층 형성을 얻기 위해 배양 조건에 초점을 맞추는 이전에 출판 된 방법31과 어느 정도 유사합니다. 시험관 내 조기 위도 발생 에 대한 연구. 우리의 목표는 세포의 집합적인 조직이 통계적인 분석 후에 명백하게 될 수 있는 시험관에서 패턴 대형의 발견을 위한 일반화 가능한 파이프라인을 제공하는 쪽으로 더 집중됩니다. 이러한 이유로, 우리는 여러 식민지에 걸쳐 3D 공간에서 핵 위치를 정확하게 식별하고 분석 할 수있는 강력한 이미지 분석 워크플로우를 제공합니다 (이 방법의 ‘이점 및 한계’섹션을 참조하십시오. 토론)을 참조하십시오. 우리는 또한 우리가 지역 사회에 도움이 될 것입니다 희망 장기적으로 상업적으로 사용할 수있는 솔루션에 대한 보다 유연하고 저렴한 대안을 제공하는 간단한 사내 마이크로 패턴 화 접근 방식을 개발하기로 결정했다.
마지막으로, 이 원고의 개정 과정에서 R 스크립트와 유사한 시험관 내 패터닝 분석을 위한 새로운 패키지가32로출시되었습니다. 이 새로운 패키지는 높은 처리량 이미징 플랫폼에서 얻을 수 있는 입력으로 셀 기능 테이블을 허용합니다. 우리는 우리가 이 가능성을 스스로 시험하지 는 않았지만 우리의 프로토콜의 7 단계에서 생성된 핵 기능의 표가 원칙적으로 이 새로운 패키지에 대한 입력으로 작용할 수 있다고 믿습니다.
다른 셀 유형 및 콜로니 형상에 대한 방법의 적응성
우리는 혈청의 존재에 있는 만능 세포의 배양에 있는 중피 전사 요인의 출현을 공부의 맥락에서 이 접근을 제시합니다. 그러나 이 방법은 ECM/poloxamer 407 농도를 최적화하는 것이 필요할 수 있지만 다른 세포 유형 및 무혈청 배양에 쉽게 적응할 수 있습니다(문제 해결 가이드의 경우 테스트된 농도에 대해서는 표 1 및 표 2 참조). 이 방법은 또한 사용자의 요구에 따라 더 크거나 작은 크기의 마이크로 패턴과 다양한 모양에 적응할 수 있습니다. 그러나 메서드를 설정하는 동안 모든 모양/셀 유형 조합이 최적이 아님을 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들어, mESC는 E-cadherin33,34의 높은 수준을 표현하여 이러한 세포가 ECM이 없는 영역에 걸쳐 집단 구조를 형성할 수 있게 합니다. 이러한 셀은 날카로운 각도로 형상을 엄격하게 따르지 않거나 패턴에 작은 구멍이 포함되어 있지 않습니다. 예를 들어 그림 3B의링에서 세포가 중앙 영역을 식민지화하는 과정에 있음을 알 수 있습니다. 우리의 손에 작은 중앙 영역은 고리 모양의 식민지를 형성하는 mESC를 강제하지 않았다. 따라서 셀 유형에 적합한 최적의 크기와 곡률을 테스트하고 식별할 수 있도록 포토마스크를 설계하는 동안 다양한 형상을 포함하는 것이 좋습니다.
고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 실험의 길이 및 세포의 증식 속도입니다. 일부 급속하게 증식하는 세포 유형(다능성 세포 포함)의 경우 며칠 동안 미세 패턴에서 세포를 유지하기어려울 수 있습니다(mESC의 경우 3일은 최대입니다). 또한, 마이크로 패턴에 세포의 파종은 항상 모든 식민지에 대해 최적으로 발생하지 않습니다, 그래서 여분의 식민지를 종자하는 것이 좋습니다.
패턴 감지 방법의 장점과 한계
이 방법의 한 가지 특별한 장점은 여러 복제 콜로니에서 이미지 분석 결과를 결합하여“평균” 패턴을 감지하는 기능입니다(그림 5). 이것은 개별 식민지의 검사에서 명백하지 않은 패터닝 이벤트를 나타낼 수 있습니다. 이 ‘평균화’ 접근 방식의 단점은 작은 반점이나 좁은 줄무늬와 같은 특정 유형의 반복적 패턴을 놓칠 수 있다는 것입니다. 그러나 이러한 유형의 패턴은 신중하게 선택된 패턴 크기8의조합으로 대신 밝혀질 수 있습니다. 또한, 여기에 설명된 이미지 분석 파이프라인은 단일 셀 및 콜로니 해상도 모두에서 정량적데이터를 제공하여 식민지 간 가변성의 수준을 조사하거나 여러 개의 개체간 분석을 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다(그림 5). 저울10.
평균화 방법의 또 다른 중요한 장점은 검출 채널의 사용 가능한 형광단에 의해 제한되지 않고 많은 마커의 우대 위치를 매핑할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 실제로, 우리는 여기에 제시 된 작품에서 차별화의 두 마커를 사용하지만, 식민지를 표준화하고 “평균”패턴을 추출 할 수있는 기능을 사용하면 순서대로 함께 식민지의 다른 세트에서 분포지도를 비교 할 수 있습니다 마커의 일반화된 공간 관계를 서로 드러낸다.
또한, 여기에서 우리의 초점은 분화의 마커를 공부하는 것이었지만, 분석 방법은 핵 마커가 유효한 그밖 생물학 프로세스를 공부하기 위하여 확장될 수 있습니다. 예를 들어 형광 유비퀴틴세포 주기 표시기 35(FUCCI)를 포함하는 세포주들의 미세패킹은 콜로니 레벨 지오메트리가 그룹의 세포 주기 사건에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 연구할 수 있게 한다.
향후 방향
이 방법은 중간 처리량 이미지 분석에 적합하지만 이미지 수집은 현재 완전히 자동화되지 않았으며 매우 큰 실험에 제한이 될 수 있습니다. 식민지의 정기적 인 배열은 가능한 가능한 단일 세포 평균20에대해 개발 된 것과 유사한 완전히 자동화 된 수집 루틴을 만들 수 있어야합니다. 그러나 식민지를 이미지화하는 데 필요한 필드의 크기가 크기 때문에 모자이크킹이 필요할 수 있으며, 식민지가 3차원이기 때문에 관련 콜로니만 이미징하여 데이터 집합 크기와 수집 시간을 모두 줄이는 것이 매우 바람직합니다. 따라서, 미래의 노력은 관련 식민지를 확인하고 각 견본에 화상 진찰 좌표를 적응할 수 있는 ‘지능형’ 현미경을 개발하기 위하여 전념할 수 있습니다. 이렇게 하면 시간과 노력이 줄어들뿐만 아니라 잠재적인 작업자 편향을 방지할 수 있습니다.
분석 파이프라인은 사용자가 수행해야 하는 단계 수를 줄여 효율성을 높일 수도 있습니다. 우리는 파이프 라인 구축 메커니즘을 구축하고 우리의 소프트웨어에 직접 R을 통합 할 계획이있다 (또한 문제 pickcells-api #3 및 우리의 코드 리포지토리의 문제 추적기에서 pickcells-rjava #1 참조 [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). 분석 절차를 완전히 자동화하면 시간과 노력이 줄어들고 잠재적인 사용자 오류가 제한됩니다.
마지막으로, 분석 방법은 아직 셀룰러 패터닝의 동적 특성을 완전히 포착하지 못합니다. 일부 제한된 동적 정보는 스냅샷 이미지8,10,36의타임시리즈를 검사하여 추출할 수 있습니다. 그러나, 우리가 패터닝이 어떻게 나타나는지 더 잘 이해하길 원한다면 세포 집단의 역사를 기록할 수 있다는 것은 매우 바람직하다. 한 가지 제한은 3D 조밀한 세포 집단에 있는 개별세포의 정확한 추적이 37의 매우 도전적인 작업 남아 있다는 것입니다. 우리의 세포 검출 방법은 핵 봉투를 사용하고 조밀하고 중첩된 세포 집단28에서특히 잘 수행한다. 핵 봉투의 라이브 리포터는28,38 및 마이크로패터닝 기술의 한 가지 장점은 장기간 이미징 동안 세포가 시야 밖에서 이동하는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 전반적으로, 우리는 세포의 자동화 된 추적이 최근에 설립 된 도구28,39,40의 조합을 사용하여 달성 될 것이라고 확신하고이 기본에 새로운 통찰력을 가져와야한다 자기 조직의 원칙.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 헨리 웰컴 박사 후 펠로우십 (WT100133에서 G.B.), 웰컴 트러스트 수석 펠로우십 (WT103789AIA to S.L.), 웰컴 트러스트 박사 과정 학생십 (108906 /Z/ Z / Z – D.W.)에 의해 지원되었습니다. 우리는 또한 마누엘 테리 박사가 포토패킹 기법에 대한 조언을 해주신 것에 대해 감사드립니다.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |