Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA
Summary
A especificidade da sequência é fundamental para a regulação genética. As proteínas reguladoras que reconhecem sequências específicas são importantes para a regulação genética. Definir locais de ligação funcionais para essas proteínas é um problema biológico desafiador. Uma aproximação iterativo para a identificação de um local obrigatório para uma proteína RNA-obrigatória é descrita aqui e é aplicável a todas as proteínas RNA-obrigatórias.
Abstract
O Regulamento genético desempenha um papel importante em todas as células. Os passos transcricional, pós-transcricional (ou processamento de RNA), translacionais e pós-translacionais são usados para regular genes específicos. As proteínas de ligação de ácidos nucleicos específicos de sequência destinam-se a sequências específicas para controlar a expressão genética espacial ou temporal. Os sítios de ligação em ácidos nucleicos são tipicamente caracterizados pela análise mutacional. Entretanto, as proteínas numerosas do interesse não têm nenhum local obrigatório conhecido para tal caracterização. Aqui nós descrevemos uma aproximação para identificar locais previamente desconhecidos da ligação para proteínas RNA-obrigatórias. Envolve a seleção iterativa e a amplificação das seqüências que começam com uma associação aleatorizada da seqüência. Após várias rodadas destes passos-transcrição, ligação e amplificação-as sequências enriquecidas são sequenciadas para identificar um local de ligação preferencial (s). O sucesso dessa abordagem é monitorado por meio de ensaios de ligação in vitro. Posteriormente, ensaios funcionais in vitro e in vivo podem ser utilizados para avaliar a relevância biológica das sequências selecionadas. Esta aproximação permite a identificação e a caracterização de um local (s) obrigatório previamente desconhecido para toda a proteína RNA-obrigatória para que um ensaio para separar RNAs proteína-ligadas e não acoplado existe.
Introduction
Na biologia celular, a regulação gênica desempenha um papel central. Em uma ou várias etapas ao longo da via de expressão gênica, os genes têm o potencial para ser regulado. Estas etapas incluem a transcrição (iniciação, alongamento, e terminação) assim como a emenda, a poliadenilação ou a formação final de 3 ‘, a exportação do RNA, a tradução do mRNA, e a deterioração/localização de transcritos preliminares. Nestas etapas, as proteínas de ligação ácida nucleico modulam a regulação genética. A identificação de sítios de ligação para essas proteínas é um aspecto importante do estudo do controle genético. A análise mutacional e a comparação da sequência filogenética têm sido usadas para descobrir sequências regulatórias ou sítios de ligação protéica em ácidos nucleicos, como promotores, sítios de emenda, elementos de poliadenilação e sinais translacionais1, 2. º , 3. º , a 4.
A emenda do pre-mRNA é uma etapa integral durante a expressão e a regulação do gene. A maioria dos genes mamíferos, incluindo aqueles em seres humanos, têm introns. Uma grande fração destas transcrições é alternativamente emunida, produzindo o mRNA múltiplo e as isoformas da proteína do mesmo gene ou transcrição preliminar. Essas isoformas têm funções específicas de células e de desenvolvimento na biologia celular. O 5 ‘ Splice site, o ramo-ponto, e o polypyrimidine-Tract/3 ‘ Splice site são críticos de emenda de sinais que estão sujeitos a regulamentação. No Regulamento negativo, um local de outra maneira forte da tala é reprimido, visto que no Regulamento positivo um local de outra maneira fraco da tala é ativado. Uma combinação desses eventos produz uma infinidade de isoformas funcionalmente distintas. As proteínas de ligação ao RNA desempenham papéis-chave nestes eventos alternativos de splicing.
As proteínas numerosas são conhecidas cujos os alvos do local (s) ou do RNA da ligação permanecem ser identificados5,6. Ligar as proteínas reguladoras aos seus alvos biológicos a jusante ou sequências é frequentemente um processo complexo. Para essas proteínas, a identificação de seu RNA alvo ou local de ligação é um passo importante na definição de suas funções biológicas. Uma vez que um local obrigatório é identificado, pode ser caracterizado mais mais usando análises moleculars e bioquímicas padrão.
A abordagem descrita aqui tem duas vantagens. Primeiramente, pode identificar um local previamente desconhecido da ligação para uma proteína do interesse. Em segundo lugar, uma vantagem adicional desta aproximação é que permite simultaneamente a mutagenese da saturação, que de outra maneira seria labor intensivo para obter a informação comparável sobre exigências da seqüência dentro do local obrigatório. Assim, oferece uma ferramenta mais rápida, mais fácil, e menos cara para identificar locais da ligação da proteína no RNA. Originalmente, essa abordagem (SELEX ou evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial) foi utilizada para caracterizar o local de ligação para o bacteriófago T4 DNA polymerase (Gene 43 protein), que se sobrepõe ao local de ligação Ribossome em seu próprio mRNA. O site de vinculação contém uma sequência de loop de 8-base, representando 65.536 variantes aleatórias para análise7. Em segundo lugar, a abordagem também foi usada de forma independente para mostrar que locais de ligação específicos ou aptâmeros para diferentes corantes podem ser selecionados a partir de um pool de aproximadamente 1013 sequências8. Na verdade, essa abordagem tem sido amplamente utilizada em muitos contextos diferentes para identificar aptâmeros (seqüências de RNA ou DNA) para ligar numerosos ligantes, tais como proteínas, pequenas moléculas e células, e para catálise9. Como exemplo, um aptâmeros pode discriminar entre dois derivados de xantina, cafeína e Teofilina, que diferem pela presença de um grupo metilo na cafeína10. Nós usamos extensivamente esta aproximação (Selex ou seleção-amplificação iterativo) para estudar como as proteínas RNA-obrigatórias funcionam na emenda ou na regulação de emenda11, que será a base para a discussão abaixo.
A biblioteca aleatória: nós usamos uma biblioteca aleatória de 31 nucleotides. A consideração de comprimento para a biblioteca aleatória foi vagamente baseada na idéia de que o fator de emenda geral U2AF65 vincula a uma seqüência entre a seqüência de ponto de ramificação e o site de Splice 3 ‘. Em média, o espaçamento entre esses sinais de splicing em metazoanos está na faixa de 20 a 40 nucleotídeos. Uma outra proteína sexo-letal era sabido para ligar a uma seqüência regulamentar mal caracterizada perto do 3 ‘ local da tala de seu alvo pre-mRNA, transformador. Assim, optou-se por uma região aleatória de 31 nucleotídeos, ladeada por sítios de encadernação com sítios enzimáticos de restrição para permitir a amplificação de PCR e a fixação do promotor de RNA polimerase T7 para transcrição in vitro. O tamanho ou complexidade teórico da biblioteca foi de 431 ou aproximadamente 1018. Utilizamos uma pequena fração desta biblioteca para preparar nosso pool de RNA aleatório (~ 1012-1015) para os experimentos descritos abaixo.
Protocol
Representative Results
Discussion
As proteínas de ligação de ácidos nucleicos são importantes reguladores do desenvolvimento animal e vegetal. Um requisito fundamental para o procedimento SELEX é o desenvolvimento de um ensaio que pode ser usado para separar frações de RNA ligadas à proteína e não acopladas. Em princípio, este ensaio pode ser um ensaio de ligação in vitro, como o ensaio de ligação de filtro, o ensaio de deslocamento de mobilidade em gel ou um ensaio de ligação matricial19 para proteínas recombin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor agradece aos institutos nacionais de saúde pelo financiamento passado.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
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