探索序列空间,识别调节RNA结合蛋白的结合位点
Summary
序列特异性对基因调控至关重要。识别特定序列的调控蛋白对基因调控非常重要。为这种蛋白质定义功能结合位点是一个具有挑战性的生物学问题。此处描述了一种用于识别RNA结合蛋白结合位点的迭代方法,适用于所有RNA结合蛋白。
Abstract
基因调节在所有细胞中起着重要的作用。转录、转录后(或RNA处理)、翻译和翻译后步骤用于调节特定基因。序列特异性核酸结合蛋白针对特定序列来控制空间或时间基因表达。核酸中的结合位点通常以突变分析为特征。然而,许多感兴趣的蛋白质没有已知的结合位点进行这种表征。在这里,我们描述了一种识别RNA结合蛋白以前未知的结合位点的方法。它涉及从随机序列池开始的序列的迭代选择和放大。经过几轮这些步骤的转录、绑定和扩增,富集序列被序列为识别首选的绑定位点。使用体外结合测定法对这种方法的成功进行监测。随后,体外和体内功能测定可用于评估所选序列的生物相关性。这种方法允许识别和表征任何RNA结合蛋白的先前未知的结合位点,而该蛋白存在分离蛋白质结合和未结合RNA的测定。
Introduction
在细胞生物学中,基因调控起着核心作用。在基因表达途径的一个或多个步骤中,基因具有被调节的潜力。这些步骤包括转录(启动、伸长和终止)以及拼接、多化或3’端形成、RNA导出、mRNA翻译和初级转录的衰变/定位。在这些步骤中,核酸结合蛋白调节基因调控。识别这种蛋白质的结合位点是研究基因控制的一个重要方面。突变分析和遗传序列比较已用于发现核酸中的调控序列或蛋白质结合位点,如启动子、拼接位点、聚化元素和转化信号1。2,3,4.
前mRNA拼接是基因表达和调控过程中不可或缺的一步。大多数哺乳动物的基因,包括人类的基因,都有内源基因。这些转录本的很大一部分是交替拼接的,从同一基因或主转录本产生多个mRNA和蛋白质异构体。这些等体在细胞生物学中具有细胞特异性和发育作用。5′ 拼接位点、分支点和聚苯乙烯-3’拼接位点是受监管的关键拼接信号。在负调节中,否则强接头位被抑制,而在正调节中,否则弱拼接位点被激活。这些事件的组合会产生大量功能上不同的异形。RNA结合蛋白在这些替代拼接事件中起关键作用。
许多蛋白质是已知的,其结合位点或RNA靶点仍有待确定5,6。将调节蛋白与其下游生物靶点或序列联系起来通常是一个复杂的过程。对于此类蛋白质,识别其靶向RNA或结合位点是确定其生物功能的重要一步。一旦确定结合位点,可以使用标准的分子和生化分析进一步描述它。
此处描述的方法有两个优点。首先,它可以识别一个以前未知的结合位点,用于感兴趣的蛋白质。其次,这种方法的一个附加优势是,它同时允许饱和突变,否则,为了获得绑定站点中序列要求的可比信息,这将会是劳动密集型的。因此,它提供了一个更快,更容易,成本更低的工具,以确定RNA中的蛋白质结合位点。最初,这种方法(SELEX或通过易解体扩能对利坦的系统性进化)用于表征噬菌体T4DNA聚合酶(基因43蛋白)的结合位点,该结合位点与核糖体结合位点在其自己的mRNA中重叠。绑定站点包含一个 8 基循环序列,表示用于分析7的 65,536 个随机变体。其次,该方法还被独立用于表明,可以从大约10个13个序列8的池中选择不同染料的特定结合位点或贴合剂。事实上,这种方法已经在许多不同的环境中广泛使用,用于识别用于结合许多配体(如蛋白质、小分子和细胞)的贴合剂(RNA或DNA序列),以及催化9。例如,一个贴皮剂可以区分两种黄烷衍生物,咖啡因和茶碱,它们因咖啡因10中一个甲基组的存在而不同。我们广泛使用这种方法(SELEX或迭代选择-放大)来研究RNA结合蛋白在拼接或拼接调节11中的作用,这将是下面讨论的基础。
随机库:我们使用31个核苷酸的随机库。随机库的长度考虑松散地基于一种理念,即一般拼接因子 U2AF65绑定到分支点序列和 3′ 拼接站点之间的序列。平均而言,元群中这些拼接信号之间的间距在20至40个核苷酸范围内。另一种蛋白质性致命已知结合一个不良特征的调节序列附近的3’拼接位,其目标前mRNA,变压器。因此,我们选择了31个核苷酸的随机区域,两侧是具有限制性酶位点的引物结合位点,以允许PCR扩增和附件T7RNA聚合酶启动子进行体外转录。理论库大小或复杂性为431或约1018。我们使用这个库的一小部分来准备我们的随机RNA池(#10 12-1015)用于下面描述的实验。
Protocol
Representative Results
Discussion
核酸结合蛋白是动植物发育的重要调节剂。SELEX 程序的一个关键要求是开发可用于分离蛋白质结合和未结合的 RNA 馏分的测定。原则上,此测定可以是体外结合测定,如滤芯结合测定、凝胶移动转移测定或重组蛋白、纯化蛋白或蛋白质复合物的基质结合测定19。测定也可以是酶测定,其中前体和产品(或中间体)可以根据大小或其他某种方式分离20。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢国家卫生研究院过去的资助。
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
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