Hier stellen wir ein Protokoll vor, um schweres TBI mit dem lateralen Fluid Percussion Injury (FPI) Modell bei erwachsenen, männlichen Wistar Ratten zu induzieren. Wir zeigen auch den Einsatz eines drahtlosen Telemetriesystems, um kontinuierliche Video-EEG-Aufnahmen zu sammeln und epileptiforme Entladungen zu überwachen, die mit der posttraumatischen Epileptogenese übereinstimmen.
Das Modell der lateralen Fluid Percussion Injury (FPI) ist etabliert und wurde zur Untersuchung von TBI und posttraumatischer Epilepsie (PTE) verwendet. Es wurden jedoch erhebliche Unterschiede bei den spezifischen Parametern gemeldet, die in verschiedenen Studien verwendet wurden, die dieses Modell verwendet haben, was es schwierig macht, die Ergebnisse zwischen Laboratorien zu harmonisieren und zu interpretieren. Zum Beispiel wurde eine Variabilität bezüglich der Größe und Lage der Kraniektomie, wie die Luer-Schleusennbenabe relativ zur Kraniektomie platziert wird, der atmosphärische Druck, der auf die Dura ausgeübt wird, und die Dauer des Druckimpulses berichtet. Jeder dieser Parameter kann sich auf die Schwere der Verletzungen auswirken, die direkt mit der Inzidenz von PTE korreliert. Dies hat sich als eine breite Palette von Sterblichkeitsraten manifestiert, die Reflexzeiten und die Inzidenz von Krampfanfällen, die berichtet werden, richtig machen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Methode zur Verfügung, die wir verwendet haben, um die Harmonisierung zwischen den Studien zu erleichtern. Wir verwendeten FPI in Kombination mit einem drahtlosen EEG-Telemetriesystem, um kontinuierlich auf elektrografische Veränderungen zu überwachen und Anfallsaktivitäten zu erkennen. FPI wird durch die Schaffung einer 5 mm Kraniektomie über der linken Hemisphäre, zwischen dem Bregma und Lambda und neben dem seitlichen Kamm induziert. Eine Luer-Verriegelungsnabe ist über der Kraniektomie auf dem Schädel befestigt. Diese Nabe ist mit dem FPI-Gerät verbunden, und ein 20-Millisekunden-Druckimpuls wird direkt an die intakte Dura über Druckschläuche geliefert, die über einen Drehverschlussanschluss mit der Nabe verbunden sind. Nach der Genesung werden Ratten erneut anästhesiert, um den Hub zu entfernen. Fünf EEG-Elektrodenschrauben aus Edelstahl aus 0,5 mm werden durch den Schädel mit der Dura in Berührung gebracht und dienen als vier Aufnahmeelektroden und eine Referenzelektrode. Die Elektrodendrähte werden in einem Sockelverbinder gesammelt, der mit Knochenzement befestigt ist. Kontinuierliche Video-/EEG-Aufnahmen werden bis zu 4 Wochen nach TBI gesammelt.
In einem Bericht an den Kongress aus dem Jahr 2015 berichteten die Centers for Disease Control, dass etwa 2,5 Millionen Menschen pro Jahr traumatische Hirnverletzungen (TBI) in den USA erleiden1. Es wird geschätzt, dass TBI 20% der symptomatischen Epilepsien und 5% aller Epilepsien2,3,4verursacht. Darüber hinaus entwickeln etwa 20% der TBI-Patienten eine posttraumatische Epilepsie5. Wichtig ist, chronische, wiederkehrende Anfälle, die als Folge von TBI auftreten, sind oft pharmakoresistent, was die Belastung der Krankheit erhöht6. Die genauen Mechanismen, die zu posttraumatischer Epilepsie (PTE) führen, bleiben unklar. Mehrere wichtige epidemiologische Studien haben jedoch die Inzidenz und das potenzielle Risiko der Entwicklung einer posttraumatischen Epilepsie (PTE)untersucht 2,4,7,8,9 ,10,11. Diese epidemiologischen Studien verstärkten jeweils die Korrelation der Verletzungsschwere mit dem Risiko einer Epileptogenese.
Aktuelle Methoden, die ausgiebig zur Identifizierung neuartiger Anti-Epilepsie-Therapien eingesetzt wurden, haben sich stark auf Modelle verlassen, die Chemokonvulsiva oder elektrische Surlepsie verwenden, um Epilepsie zu induzieren12. Angesichts der hohen Inzidenz von Pharmakoresistenz entwinnen und fachlichen Mitteln, die in diesen Modellen von TBI-Patienten entwickelt wurden, gehen wir davon aus, dass sich TBI-induzierte Anfälle von Chemokonvulsiva oder entzündeten Epileleptogenese. Daher kann ein TBI-Modell besser für die Entwicklung von Behandlungen geeignet sein, die effektiver sind, um posttraumatische Epileleptogenese zu verhindern.
Das Fluid Percussion Injury (FPI) Modell von TBI wird seit Jahrzehnten verwendet und ist eine etablierte Methode, um sowohl TBI als auch PTE13,14,15,16,17, 18. Wie wir jedoch kürzlich überprüft haben, gibt es eine hohe Variabilität der FPI-Methoden, die in den Laboratorien gemeldet werden19,20. Dieser Mangel an Konsistenz zwischen Laboratorien verhindert die Reproduzierbarkeit präklinischer Befunde und macht die Interpretation der Ergebnisse zu einer Herausforderung. Infolgedessen wurden das Interesse und die Bemühungen um eine stärkere Harmonisierung dieser Studienartenverstärkt21,22,23,24.
In dem Bestreben, die Konsistenz und Harmonisierung zwischen Laboratorien, die sich auf die Untersuchung der posttraumatischen Epileleptogenese konzentrieren, weiter zu erhöhen, stellen wir hier eine detaillierte Methodik unseres Ansatzes zur Verfügung. Wir haben zuvor eine 60%ige Inzidenz von Krampfanfällen innerhalb von sechs Wochen nach schweren TBI20berichtet. Wir verwenden diesen Ansatz nun, um Ratten zu überwachen, die den Tag der Verletzung beginnen, und sie kontinuierlich 24 Stunden am Tag für bis zu 4 Wochen zu verfolgen. Wir haben uns für ein drahtloses Telemetriesystem entschieden, das mehrere Vorteile bietet. Erstens können sich Ratten frei um ihren Käfig bewegen und reduzieren so Stress. Zweitens eine Reduzierung des Signalrauschens, da die Ratte als Boden dient. Darüber hinaus verwendet unser aktuelles System einen Beschleunigungsmesser, der schnelle Bewegungen in allen drei Ebenen (X, Y und Z) erkennt und hilfreich sein kann, um krampfhafte Anfallsereignisse zu identifizieren. Schließlich ermöglicht das drahtlose Telemetriesystem ein einfacheres Management von Ratten wie zusätzliche Saline-Injektionen, Wiegen und Durchführen von neurologischen Schweregraden, was kompliziert ist, wenn Ratten an einem Tether befestigt sind. Dieser Ansatz hat jedoch auch mehrere Einschränkungen. Erstens können die anfänglichen Kosten eines Systems, das von bis zu acht Ratten gleichzeitig erfasst wird, im Bereich von 60.000 US-Dollar liegen. Zweitens wird die Stromversorgung durch eine Batteriequelle begrenzt. Dies erfordert eine tägliche Überwachung und den Austausch von Batterien. Die zwischen den Batteriewechseln benötigte Zeit kann durch die Abtastrate beeinflusst werden. Bei einer Abtastrate von 1000 Hz werden Batterien jedoch in der Regel einmal pro Woche gewechselt. Die begrenzte Stromversorgung beschränkt das System auch auf die Aufzeichnung von nur vier EEG-Signalen. Schließlich ist das Signalaussetzer begrenzt, tritt aber gelegentlich auf. Dieser Ansatz bietet jedoch eine konsistente und zuverlässige Methode zur Überwachung der posttraumatischen Epileptogenese und kann bei der Identifizierung neuartiger therapeutischer Behandlungen helfen.
Es wurden erhebliche Unterschiede zwischen Laboratorien hinsichtlich der spezifischen Parameter und Methoden des FPI TBI-Modells 14,26,27,28berichtet. Diese Inkonsistenzen haben zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt und erschweren die Harmonisierung der Bemühungen und Ergebnisse zwischen den Labors. Hier haben wir eine detaillierte Methodik vorgestellt, die unseren Ansatz zur langfristigen, kontinuierlichen Aufzeichnung von Video/EEG zur Überwachung posttraumatischer epileptiformer Aktivität beschreibt. Eine Reihe von Schritten sind entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse mit der beschriebenen Methode zu generieren.
Erstens, da die Inzidenz von posttraumatischer Epilepsie mit der Schwere der Verletzung korreliert, gelten Bedingungen, die zu den schwersten TBI führen. Verwenden Sie insbesondere eine 5 mm Kraniektomie, um sicherzustellen, dass eine ausreichend große Dura-Fläche freigelegt wird. Darüber hinaus sichern Sie eine weiblich-weibliche Luer-Verriegelung auf der Oberfläche des Schädels, wobei die Öffnung direkt über der Kraniektomie platziert wird. Dies unterscheidet sich von anderen Labors, die eine kleinere Kraniektomie (3 mm) verwendet und/oder eine modifizierte Nadelnbenabe in die Kraniektomie gelegt haben, was die Öffnungsgröße effektiv reduziert. Durch platzieren des Luer-Schlosses außerhalb der Kraniektomie wird die 5mm-Öffnung beibehalten. Diese spezifischen Parameter wirken sich auf die Gesamtkraft aus, die auf die Dura angewendet wird. Der atmosphärische Druck, der auf die Dura ausgeübt wird, hat auch einen großen Einfluss auf die Schwere der beobachteten Verletzung. Leider ist der Luftdruck sehr variabel und scheint geräteabhängig zu sein. Einige Labore haben berichtet, einen Druckimpuls von 8 – 10 ms18anzuwenden. Im Gegensatz dazu ergibt die hier beschriebene Methode einen Druckimpuls von 20 ms. Dies stimmt mit anderen Labors überein, die schwerere Verletzungen zu verursachen scheinen 14,28. Es ist klar, dass der verletzungsfördernde Druckimpuls ein Parameter ist, der eine erhebliche Variabilität zwischen Laboren zeigt und empirisch definiert werden muss. Die Schwere der Verletzung kann jedoch auf der Grundlage einer Kombination von Sterblichkeitsraten (40-50%), der Richtigen Reflexzeiten (>30 min)26bestimmt werden. Es ist auch wichtig, dass nur Tiere mit einer intakten Dura in die Studie einbezogen werden. Darüber hinaus, wenn die Kraniektomie durch einen Klebstoff oder Zement so okkludieren, dass ein Teil der Dura unter der Kraniektomie nicht der vollen Kraft des Flüssigkeitsdruckimpulses ausgesetzt ist, dann sollte das Tier aus der Studie eliminiert werden. Auch überschüssiger Kleber unter dem Luer-Schloss kann an der Dura haften und mit der Zementkappe auch nach einer erfolgreichen Verletzung entfernen. Schließlich gibt die glatte Form der Druckimpulskurve auf der Oszilloskopspur den Hinweis, dass sich keine Luftblasen in der Flüssigkeitskammer befinden, und zeigt an, dass sich der Kolben ohne Impedanz bewegt.
Anästhesie ist ein weiterer kritischer Faktor, der kontrolliert werden muss. Isoflurane Exposition sollte auf den niedrigsten Niveau möglich gehalten werden, um eine chirurgische Ebene der Anästhesie zu halten. Ratten, die höheren Isofluran- oder längeren Dauern ausgesetzt sind, entwickeln eher neurogen-induzierte Lungenödeme. Die Vorbereitung des Schädels stellt einen weiteren kritischen Aspekt der Methode dar. Insbesondere das Trocknen des Schädels und das Entfernen von Knochenstaub hilft, die Ratten daran zu hindern, den Sender vorzeitig zu entfernen.
Die Platzierung der Schrauben und der Anschluss der EEG-Drähte sind offensichtlich entscheidend für die Produktion konsequent reproduzierbarer Aufnahmen. Es ist wichtig, dass die Schrauben nicht zu tief platziert werden, um eine Läsion auf dem Gehirn zu induzieren. Die Knochenklappe, die von der Kraniektomie der erwachsenen (12 Wochen alten) männlichen Wistar-Ratten geborgen wurde, ist durchweg 2 mm dick. Verwenden Sie EEG-Elektrodenschrauben mit einer 2,5 mm Welle. Es ist hilfreich, die Spitzen der gekrümmten Mückenhämostatik Zange als Abstandser zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Schrauben nur bis zur Basis des Knochens reichen und nicht in das Gehirn ragen.
Der hier vorgestellte Ansatz hat einige Einschränkungen. Die Batterien müssen regelmäßig gewechselt werden. Die Häufigkeit von Batteriewechseln hängt von der Abtastrate ab. Batterien werden in der Regel einmal pro Woche bei einer Abtastrate von 1000 Hz gewechselt. Dieser Zeitrahmen kann durch eine Reduzierung der Abtastrate verlängert werden. Das System beschränkt sich auch auf die Aufzeichnung von vier monopolaren EEG-Elektroden. Dies bietet jedoch zwei Kanäle pro Hemisphäre und kann zwischen fokalen und verallgemeinerten Ereignissen unterscheiden und zwischen vorderen und hinteren Veränderungen unterscheiden. Trotz dieser Einschränkungen bietet dieser Ansatz eine vernünftige Methode zur kontinuierlichen Video-/EEG-Überwachung und Detektion von epilepptiformen Veränderungen nach schweren TBI-Änderungen.
Die hier beschriebene Methode führt sowohl zu elektrografischen als auch zu krampfhaften Anfällen innerhalb eines Monats nach TBI. Daher bietet dieser Ansatz einen angemessenen Zeitrahmen, in dem potenzielle Therapeutika zur Vorbeugung von Epileptogenese nach schwerem TBI untersucht werden können. Dieser Ansatz bietet auch eine Methode zur Untersuchung der molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit PTE und kann zur Identifizierung potenzieller Biomarker führen, die verwendet werden können, um Patienten zu identifizieren, die am meisten von der Entwicklung von PTE betroffen sind.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Paul Dressel für seine unschätzbare Unterstützung bei der grafischen Gestaltung und Erstellung von Figuren.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |