Описан процесс изготовления, многослойного, микрофлюидного устройства, позволяющего выполнять в пробирке транскрипцию и перевод (IVTT) в течение длительных периодов времени. Кроме того, предоставляется всеобъемлющий обзор аппаратного и программного обеспечения, необходимого для автоматизации и поддержания этих реакций в течение длительного времени.
Ограничения клеточной синтетической биологии становятся все более очевидными по мере того, как исследователи стремятся разработать более крупные и более сложные синтетические генетические регулятивные схемы. Анализ синтетических генетических регуляторных сетей in vivo занимает много времени и страдает от отсутствия экологического контроля, при этом экзогенные синтетические компоненты взаимодействуют с процессами пребывания, что приводит к нежелательному поведению. Чтобы преодолеть эти проблемы, безклеточная характеристика новых схем становится все более распространенным. В пробирке транскрипции и перевода (IVTT) смеси позволяют регулировать экспериментальную среду и могут быть оптимизированы для каждой уникальной системы. Представленные здесь протоколы подробно изготавливают изготовление многослойного микрофлюидного устройства, которое может быть использовано для поддержания реакции IVTT в течение длительного времени. В отличие от пакетных реакций, когда ресурсы истощаются с течением времени и (по-) продукты накапливаются, использование микрофлюидных устройств позволяет пополнить ресурсы, а также удаление реакционных продуктов. Таким образом, клеточная среда эмулируется путем поддержания вне равновесия среды, в которой динамическое поведение генных цепей может быть исследовано в течение длительных периодов времени. Чтобы полностью использовать многослойное микрофлюидное устройство, оборудование и программное обеспечение были интегрированы для автоматизации реакций IVTT. Объединив реакции IVTT с микрофлюидной платформой, представленной здесь, становится возможным всесторонне анализировать комплексное поведение сети, способя наше понимание механизмов, регулирующих клеточные процессы.
Клетки способны чувствовать и реагировать на окружающую среду с помощью сложных динамических регуляторныхсетей1,2. Область синтетической биологии использует наши знания о естественных компонентов, входящих в эти сети для инженера биологических систем, которые могут расширить функциональность клеток3,4. И наоборот, можно также продолжить наше понимание природных сетей, регулирующих жизнь, проектируя упрощенные синтетические аналоги существующих схем или передние инженерные биологические системы, которые демонстрируют естественное поведение. Де Ново-инженерия таких биологических систем осуществляется снизу вверх моды, где новые генетические схемы или сигнальные пути инженерии в рациональной манере, используя четко определенные части5,6. Сочетание рационального проектирования сетей с проектированием биологически значимых систем позволяет углубленной характеристики и изучение биологических систем регулирования с различными уровнями абстракции7.
Первопроходцы Elowitz и Leibler8 и Gardner et al.9 первыми продемонстрировали успешное внедрение синтетических генетических сетей в клеточные хосты. В следующем десятилетии, многочисленные исследователи продолжают опираться на эти первоначальные успехи, несмотря на появление ряда ограничений в отношении введения синтетических схем в клетки7,10,11 ,12. В идеале внедрение синтетических схем в сотовые хосты должно происходить модульным способом. К сожалению, сложность клеточной среды делает это особенно сложным, с функцией многих частей и сетей в высокой степени контекст зависит12,13,14. В результате сети часто сталкиваются с нежелательными взаимодействиями с компонентами родного узла, которые могут повлиять на функцию синтетической цепи. Аналогичным образом, компоненты экзогенной сети могут препятствовать принимающим процессам, конкурировать за общие ресурсы внутри хоста и влиять на кинетику роста15,16,17. Следовательно, для того, чтобы рационально проектировать и прогнозировать поведение синтетических сетей в среде in vivo,требуетсякомплексная модель всей динамики, специфичной для хоста и цепи.
Целесообразной альтернативой использованию сотовых хостов для характеристики синтетических сетей является применение технологий транскрипции и перевода (IVTT). Выступая в качестве испытательного дна для синтетических сетей, реакции выполняются в решениях, включающих все компоненты, необходимые для обеспечения экспрессиигенов 19,20,21. Таким образом, создается биологически актуальная, хотя и искусственная среда, в рамках которой синтетические сети могут быть протестированы22,23,24,25,26, 27,28. Основным преимуществом использования решений IVTT является способность выполнять реакции в условиях, определенных пользователем, при этом исследователи способны настроить точный состав каждой реакции2. Кроме того, подход без клеток позволяет проводить высокопроизводительные испытания синтетических сетей, поскольку он устраняет необходимость выполнения трудоемких клеточных шагов клонирования. В результате продолжительность последовательной конструкции – сборки – циклов испытаний значительно сокращается29,30,31,32. Цикл проектирования может быть еще более ускорен за счет использования клеток свободного клонирования методов, таких как сборка Гибсон быстро инженер новых сетей, а также путем построения сетей из линейных шаблонов ДНК, которые – в отличие от плазмиды, необходимые для тестирования in vivo – может быть усилена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)33,34.
Реакция пакета самый простой метод которым реакции IVTT могут быть выполнены, требуя одиночного сосуда реакции wherein все компоненты реакции совмещены35. Такие реакции достаточны для экспрессии белка и базового тестирования цепи, но оказываются недостаточными при попытке изучить долгосрочное динамическое поведение сети. В ходе пакетной реакции реагенты либо истощаются, либо подвергаются деградации, что приводит к постоянному снижению частоты транскрипции и перевода. Кроме того, по мере развития реакций накапливаются побочные продукты, которые могут помешать – или полностью ингибировать – правильное функционирование сети. В конечном счете, использование пакетных реакторов ограничивает динамическое поведение, которое можно наблюдать, с отрицательным регулированием, особенно сложным для реализации5,36.
Универсальность систем IVTT позволяет несколько альтернативных методов, с помощью которых длительные реакции IVTT могут быть выполнены, начиная от непрерывного потока на основе капель методы, а также более простые подходы диализа2,30, 37,38,39,40. Применение микрофлюидных устройств предлагает пользователям повышенный контроль над их реакциями при одновременном увеличении пропускной связи и минимизации затрат35,41,42, с каждым конкретным подходом, имеющим свой собственных преимуществ. Использование непрерывного потока может быть легко оптимизирован для увеличения доходности выражения однако, неспособность эффективно удалить конкретные продукты реакции делает изучение динамического поведения нетривиальным39. В то время как использование капель на основе микрофлюидных систем позволяет высокой пропускной результате скрининга новых сетей, трудность поставки свежих реагентов для реакции приводит к капель, напоминающих небольшой объем пакетных реакций43. Реакторы на основе диализа позволяют вводить свежие реагенты, а также удаление некоторых продуктов реакции, однако, молекулы РНК и более крупные белки накапливаются в реакторе, будучи слишком большим, чтобы рассеиваться через мембранные поры. Кроме того, большие объемы реагентов необходимы для поддержания этих реакций в течение длительных периодов30,44. В 2013 году Maerkl et al. представили многослойное микрофлюидное устройство, разработанное специально для проведения длительных реакций IVTT36,45. Использование многослойных микрофлюидных устройств позволяет прямо контролировать поток жидкости, что позволяет перенаправить поток, а также изоляцию жидкости в определенных областях устройства46,47. Эти изолированные области могут функционировать как независимые нанолитровые камеры реакции, в которых могут быть выполнены реакции IVTT. В ходе одной реакции IVTT периодические инъекции свежих реагентов в реактор используются для пополнения компонентов ИВТт и шаблонов ДНК. Одновременно с ним вытесняется равный объем старого реакционного раствора, удаляя реакционные продукты. Таким образом, вне равновесия сохраняется среда, где базальная транскрипция и скорость перевода остаются в стабильном состоянии, продлевая срок службы ivTT реакций и позволяя происходить богатое динамическое поведение. Применяя этот подход, исследователи могут исследовать кинетические темпы отдельных процессов, происходящих в рамках конкретной цепи, помогая в передовой инженерии новых генетических сетей. Например, Niederholtmeyer et al. внедрили этот подход, чтобы охарактеризовать различные элементы осциллятора генетического кольца, определив кинетические показатели36. В дальнейших исследованиях, Yelleswarapu et al. показали, что кинетическая скорость сигмы фактора 28 (No28),определяемых в условиях партии, была недостаточной для описания поведения осциллятора на основе28евро, и что добавление данных на основе потока улучшенные прогнозы моделей сетевого поведения22.
Целью данной рукописи является представление полного протокола для изготовления многослойных микрофлюидных устройств, способных выполнять долгосрочные реакции IVTT. Кроме того, в данной рукописи будет описано все аппаратное и программное обеспечение, необходимое для выполнения длительных реакций IVTT. Активация микрофлюидного устройства, необходимого для контроля потока жидкостей в ней, достигается с помощью серии пневматических клапанов, которые подключаются непосредственно к микрофлюидным устройствам по длине труб. В свою очередь, пневматические клапаны управляются с помощью специально созданного виртуального интерфейса управления. Поток жидкости в микрофлюидных устройствах достигается с помощью непрерывного давления, которое обеспечивается коммерчески доступной системой регулирования давления. Реакции IVTT обычно выполняются между 29 и 37 градусами По Цельсию, а микроскопийный инкубатор используется для регулирования температуры во время реакций. Тем не менее, функциональность смеси IVTT постепенно ухудшается при хранении выше 4 градусов по Цельсию. Таким образом, эта рукопись будет расширяться на вне чипа системы охлаждения, используемой для охлаждения смеси IVTT до инъекции в микрофлюидное устройство. В заключение, эта рукопись обеспечивает всеобъемлющий обзор процедур, необходимых для успешного выполнения длительных реакций IVTT с использованием микрофлюидного реактора потока, так что другие исследователи смогут воспроизвести эту технологию с относительной Простота.
Было представлено многослойное микрофлюидное устройство на базе PDMS, и было продемонстрировано его способность поддерживать реакции IVTT в течение длительных периодов времени. Хотя эта технология хорошо подходит для этого конкретного примера, она может быть использована для многих других приложений. Дополнительный контроль над потоком жидкости – в паре с возможностью непрерывного пополнения реагентов реакции при удалении (по)продукты – идеально подходит для непрерывного синтеза реакций, исследования различных динамических поведения, и одновременное проведение нескольких вариаций одной реакции.
Несмотря на относительно простой процесс изготовления устройств на основе PDMS, их использование требует обширной аппаратной настройки. Состоит из клапанных массивов, регуляторов давления, насосов давления, инкубаторов и холодильных установок, переход от изготовления к использованию не является элементарным и требует значительных первоначальных инвестиций. Кроме того, возможность последовательной настройки и проведения успешных экспериментов с этими устройствами требует значительных временных вложений; точка, которую эта рукопись направлена на адрес. Однако, как только на месте, вся установка может быть изменена для целого ряда целей. Кроме того, аппаратная установка включает в себя многочисленные модульные элементы, каждый из которых может быть расширен, чтобы позволить использовать более сложные микрофлюидные конструкции устройств. Кроме того, модульная конструкция позволяет заменить аппаратные компоненты аналогичным образом функционирующих альтернатив, таким образом, что пользователи не ограничиваются конкретной установки, описанной здесь48,49.
Вариабельность между отдельными устройствами и во внешних условиях (например, колебания давления) может привести к неточностям при проведении экспериментов с использованием этих устройств. Для решения этой проблемы перед каждым экспериментом должна быть проведена калибровка системы, обеспечивающая уникальное коэффициент обновления для каждого из реакторов. В то время как калибровка направлена на изменение устройства к устройству и эксперимент, это трудоемкий процесс, а не безупречный. Жидкости с различной вязкостию не будут течь с той же скоростью при воздействии одинакового давления, и как таковые выполняющие калибровку с несколькими реагентами не могут давать идентичные коэффициенты обновления. Этот эффект смягчается за счет использования трех каналов управления для перистальтно перекачивать реагенты в микрофлюидное устройство, в отличие от регулирования потока путем изменения только поставляемого давления. В крайнем случае в тех случаях, когда разница в вязкости очень велика, для каждого отдельного реагента можно внедрить уникальное коэффициент обновления, выполняя несколько экспериментов по калибровке.
Использование перистальтического насоса для введения реагентов в микрофлюидное устройство смягчает эффекты использования растворов с различной вязкосткой, однако это также создает второстепенную проблему. Использование дискретных шагов для перекачки жидкостей в микрофлюидное устройство означает, что разрешение инъекций в один реактор, ограничено объемом впрыскиваемых при выполнении одного цикла насоса. В рамках наших исследований это значение – определяется в ходе калибровки – примерно равно 1%, что свидетельствует о том, что один цикл насоса вытесняет примерно 1% от объема реактора (около 0,1 нл). Таким образом, вытеснение 30% объема реактора требует выполнения 30 циклов насоса, с 23 циклов насоса решения реакции IVTT добавляются, и только 7 циклов насоса ДНК или ультрачистой воды добавляются. Хотя для наших исследований достаточно, альтернативные экспериментальные протоколы могут столкнуться с проблемами при попытке добавить большее количество уникальных реагентов, использовать более низкий Освежающий фракции, или добавить меньшие объемы одного реагента в реактор. В таких случаях конструкция микрожидкости может быть адаптирована для обеспечения реакторов большим объемом. Пример такого приводится в Нидерхольтмайер и др.36.
Важно отметить, что устройство, описанное в этой рукописи, позволяет поддерживать реакции в течение длительных сроков, что приводит к стабильному состоянию транскрипции и ставок перевода. Периодически впрысывая новые реагенты в реакторы – и удаляя реакцию (по)продукты – реакции устойчивы и сложные динамические поведения могут контролироваться. Таким образом, была создана платформа, которая – в некоторой степени – имитирует клеточную среду. Кроме того, эта платформа позволяет исследовать динамику системы, адаптируя период между инъекциями и специфическим составом инъекций. В результате эти многослойные микрофлюидные устройства являются мощным инструментом для характеристики и оптимизации новых синтетических сетей, которые отображают сложное динамичное поведение.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом, ERC (проект N. 677313 BioCircuit) Грант NWO-VIDI от Нидерландской организации научных исследований (NWO, 723.016.003), финансирование от Министерства образования, культуры и науки (гравитация программы, 024.001.035 и 024.003.013), Программа науки о границах человека Грант RGP0032/2015, Европейский исследовательский совет в рамках научно-исследовательской программы Европейского союза Horizon 2020 Грант 723106, а также Грант Швейцарского национального научного фонда 200021_182019.
Reagents | |||
Acetone | VWR | 20063.365 | |
AZ 40 XT | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Positive Photoresist |
AZ 726 MIF Developer | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Developer Positive Photoresist |
Isopropanol | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
Microscope slides | VWR | ECN 631-1550 | |
mr Dev 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | – | Developer Negative Photoresist |
Silicon Free Heat Sink Grease | Circuit Works | CW7270 | Thermal Compound |
Silicon wafers | Silicon Materials | – | <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness |
SU-8 3050 | Microchem Corp. (Newton, MA) | – | Negative Photoresist |
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) | The Dow Chemical Company | 01317318 | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | 8x |
Camera lens | The Imaging Source | – | |
Compression fitting | Koolance, Inc. | FIT-V06X10 | Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x |
Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
Device connecting tubing | Saint-Gobain Performance Plastics | AAD04103 | 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80) |
Device connector pins | Unimed SA (Lausanne, Switserland) | 200.010-A | AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L |
Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
Female bus connector | Encitech | DTCK15-DBS-K | 15 pole female bus connector |
Fluid reservoirs | Fluigent | Fluiwell-4C | |
Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 – 345 mbar |
Hg short arc lamp | Advanced Radiation Corporation | – | 350W |
Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
LabVIEW Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Liquid coolant | Koolance, Inc. | LIQ-705CL-B | |
Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | |
Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
Matlab Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Microcamera | The Imaging Source | DMK 42AUC03 | |
Microscope camera | Hamamatsu Photonics | OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU) | |
Orbital shaker | Cole Parmer | EW-513000-05 | |
Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
PDMS puncher | SYNEO | Accu-Pucnh MP10 | |
PEEK tubing | Trajan | 1301005001-5F | 0.005" ID, 1/32" OD, Red |
Peltier element | European Thermodynamics | APH-127-10-25-S | |
Peltier temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | |
Photomask | CAD/Art Services, Inc. | – | |
Photomask Design | Maerkl Lab, EPFL | https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ | |
Pneumatic valve array | FESTO | – | 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves. |
Power adapter | Koolance, Inc. | ADT-EX004S | 110/220V AC Power Adapter |
PTFE tubing | Cole Parmer | 06417-21 | #24 AWG Thin Wall PTFE |
Punching pin | SYNEO | CR0320245N21R4 | OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm) |
PVC Tubing | Koolance, Inc. | HOS-06CL | 6 mm ID, 10 mm OD |
Single edge blades | GEM Scientific | – | |
Soft tubing | Fluigent | – | Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD) |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
Thermistor cable | Warner Instruments | TA-29 | Cable with bead thermistor |
UV exposure system | ABM, USA | – | Near UV Exposure System, 350W |
Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
Water cooled cold plate block | Koolance, Inc. | PLT-UN40F | |
Water cooler | Koolance, Inc. | EX2-755 | |
Weighing scales | Sartorius | M-prove |