Un test de stabilité cible sensible à l'affinité semi-quantitative des médicaments (DARTS) pour étudier l'interaction Rapamycin/mTOR
Summary
Dans cette étude, nous avons amélioré les capacités d’analyse de données de l’expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l’affinité des interactions protéines-ligands. Les interactions peuvent être tracées en deux courbes : une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l’interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire.
Abstract
Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) est une méthode robuste pour la détection de nouvelles cibles protéiques à petites molécules. Il peut être utilisé pour vérifier les interactions molécules-protéines connues et pour trouver des cibles protéiques potentielles pour les produits naturels. Comparé à d’autres méthodes, DARTS utilise des molécules indigènes, non modifiées, petites et est simple et facile à utiliser. Dans cette étude, nous avons encore amélioré les capacités d’analyse de données de l’expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l’affinité des interactions protéines-ligands. Les interactions protéines-ligands peuvent être tracées en deux courbes : une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l’interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire pour l’établissement de notre protocole. De la courbe protéolytique nous avons vu que la protéolyse du mTOR par pronase a été inhibée par la présence de rapamycine. La courbe dose-dépendance nous a permis d’estimer l’affinité contraignante de la rapamycine et du mTOR. Cette méthode est susceptible d’être une méthode puissante et simple pour identifier avec précision les nouvelles protéines cibles et pour l’optimisation de l’engagement cible médicamenteux.
Introduction
L’identification des petites molécules cibles des protéines est essentielle à la compréhension mécaniste et au développement de médicaments thérapeutiques potentiels1,2,3. La chromatographie d’affinité, comme méthode classique pour identifier les protéines cibles des petites molécules, a donné de bons résultats4,5. Cependant, cette méthode a des limites, en ce que la modification chimique de petites molécules entraîne souvent une spécificité ou une affinité de liaison réduite ou altérée. Pour surmonter ces limitations, plusieurs nouvelles stratégies ont récemment été développées et appliquées pour identifier les cibles de petites molécules sans modification chimique des petites molécules. Ces méthodes directes pour l’identification ciblée des petites molécules sans étiquette comprennent la stabilité de la cible sensible à l’affinité médicamenteuses (DARTS)6, stabilité des protéines des taux d’oxydation (SPROX)7, analyse thermique cellulaire (CETSA)8 ,9, et profilage protéome thermique (TPP)10. Ces méthodes sont très avantageuses parce qu’elles utilisent de petites molécules naturelles et non modifiées et ne reposent que sur des interactions de liaison directes pour trouver des protéines cibles11.
Parmi ces nouvelles méthodes, DARTS est une méthodologie relativement simple qui peut facilement être adoptée par la plupart des laboratoires12,13. DARTS dépend du concept que les protéines ligand-liées démontrent la susceptibilité modifiée à la dégradation enzymatique par rapport aux protéines non liées. La nouvelle protéine cible peut être détectée par l’examen de la bande modifiée dans le gel SDS-PAGE par spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LC-MS/MS). Cette approche a été mise en œuvre avec succès pour l’identification de cibles jusque-là inconnues de produits naturels et de médicaments14,15,16,17,18, 19. Il est également puissant comme moyen de filtrer ou de valider la liaison des composés à une protéine spécifique20,21. Dans cette étude, nous présentons une amélioration à l’expérience en surveillant les changements dans la stabilité des protéines avec de petites molécules et en identifiant les affinités de liaison protéine-ligand. Nous utilisons l’interaction mTOR-rapamycine comme exemple pour démontrer notre approche.
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTS permet d’identifier les cibles de petites molécules en exploitant l’effet protecteur de la liaison protéique contre la dégradation. DARTS ne nécessite aucune modification chimique ou immobilisation de la petite molécule26. Cela permet d’utiliser de petites molécules pour déterminer leurs cibles protéiques de liaison directe. Les critères d’évaluation standard pour la méthode Classique DARTS incluent la coloration de gel, la spectrométrie de masse et le ballonnement occidental<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus en partie par les subventions de recherche des NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, et une subvention de recherche du MINISTÈRE W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
Riferimenti
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