Rapamycin/mTOR बातचीत के अध्ययन के लिए एक अर्द्ध मात्रक औषध आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS) परख
Summary
इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तनों की निगरानी करके और प्रोटीन-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं की समानता का आकलन करके डार्ट्स प्रयोग की डेटा विश्लेषण क्षमताओं को बढ़ाया है। बातचीत दो घटता में प्लॉट किया जा सकता है: एक प्रोटीओलिटिक वक्र और एक खुराक निर्भरता वक्र. हमने एक अनुकरणीय मामले के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग किया है।
Abstract
दवा आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS) उपन्यास छोटे अणु प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए एक मजबूत तरीका है. यह ज्ञात छोटे अणु प्रोटीन बातचीत सत्यापित करने के लिए और प्राकृतिक उत्पादों के लिए संभावित प्रोटीन लक्ष्य खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य तरीकों के साथ तुलना में, DARTS देशी, असंशोधित, छोटे अणुओं का उपयोग करता है और सरल और संचालित करने के लिए आसान है. इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तनों की निगरानी करके और प्रोटीन-लिगन्ड अन्योन्यक्रियाओं की समानता का आकलन करके डार्ट्स प्रयोग की डेटा विश्लेषण क्षमताओं को और बढ़ाया है। प्रोटीन-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं को दो वक्रों में प्लॉट किया जा सकता है: एक प्रोटीओलिटिक वक्र और एक खुराक-निर्भरता वक्र। हमने अपने प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए एक अनुकरणीय मामले के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग किया है। प्रोटीओलिटिक वक्र से हमने देखा कि प्रोनेस द्वारा एमडीओआर का प्रोटीओलिसिस रैपामाइसिन की उपस्थिति से बाधित था। खुराक निर्भरता वक्र हमें rapamycin और MTOR के बंधन संबंध का अनुमान लगाने की अनुमति दी. इस विधि को सही उपन्यास लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए और दवा लक्ष्य सगाई के अनुकूलन के लिए एक शक्तिशाली और सरल तरीका होने की संभावना है.
Introduction
छोटे अणु लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए मशीनी समझ और संभावित चिकित्सीय दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है1,2,3. छोटे अणुओं के लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक शास्त्रीय विधि के रूप में एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी ने अच्छे परिणामदिए हैं 4,5. हालांकि, इस विधि की सीमाएं हैं, छोटे अणुओं के उस रासायनिक संशोधन में अक्सर कम या परिवर्तित बंधन विशिष्टता या समानता में परिणाम. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कई नई रणनीतियों हाल ही में विकसित किया गया है और छोटे अणुओं के रासायनिक संशोधन के बिना छोटे अणु लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया गया है. लेबल मुक्त छोटे अणुओं के लक्ष्य की पहचान के लिए इन प्रत्यक्ष तरीकों दवा आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS)6, ऑक्सीकरण की दर से प्रोटीन की स्थिरता (SPROX)7, सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) 8 शामिल हैं ,9, और थर्मल प्रोटीओम प्रोफाइलिंग (TPP)10. ये विधियाँ अत्यधिक लाभप्रद हैं क्योंकि वे प्राकृतिक, असंशोधित छोटे अणुओं का उपयोग करते हैं और लक्ष्य प्रोटीन11को खोजने के लिए केवल प्रत्यक्ष बाध्यकारी अन्योन्यक्रियाओं पर निर्भर करते हैं।
इन नए तरीकों में , डार्ट्स एक अपेक्षाकृत सरल पद्धति है जिसे अधिकांश प्रयोगशालाओं12,13द्वारा आसानी से अपनाया जा सकता है . डार्ट्स अवधारणा पर निर्भर करता है कि ligand बाध्य प्रोटीन असीम प्रोटीन के सापेक्ष एंजाइमी गिरावट के लिए संशोधित संवेदनशीलता का प्रदर्शन. नए लक्ष्य प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस /एमएस) के माध्यम से एसडीएस-पेज जेल में परिवर्तित बैंड की परीक्षा द्वारा पता लगाया जा सकता है। प्राकृतिक उत्पादों और औषधियों के पूर्व अज्ञात लक्ष्यों की पहचान के लिए इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है14,15,16,17,18, 19. यह एक विशिष्ट प्रोटीन20,21के यौगिकों के बंधन की जांच या सत्यापन करने के साधन के रूप में भी शक्तिशाली है . इस अध्ययन में, हम छोटे अणुओं के साथ प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तन की निगरानी और प्रोटीन-लिगंड बाध्यकारी सजातीयता की पहचान करके प्रयोग में सुधार प्रस्तुत करते हैं। हम अपने दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
डार्ट्स गिरावट के खिलाफ प्रोटीन बाइंडिंग के सुरक्षात्मक प्रभाव का शोषण करके छोटे अणु लक्ष्यों की पहचान के लिए अनुमति देता है. छोटे अणु के किसी रासायनिक संशोधन या स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंशिक रूप से NIH अनुसंधान अनुदान R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, और एक DOD अनुसंधान अनुदान W81XWH-16-1-0482 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
Riferimenti
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
