라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석
Summary
이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 향상시켰습니다. 상호 작용은 두 개의 곡선으로 플롯 될 수있다: proteolytic 곡선과 용량 의존 곡선. 우리는 모범사례로 mTOR-rapamycin 상호 작용을 사용했습니다.
Abstract
약물 선호도 반응형 표적 안정성(DARTS)은 신규한 소분자 단백질 표적을 검출하는 강력한 방법입니다. 그것은 알려진된 작은 분자-단백질 상호 작용을 확인 하 고 천연 제품에 대 한 잠재적인 단백질 목표를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 다른 방법에 비해 DARTS는 기본, 수정되지 않은 작은 분자를 사용하며 간단하고 작동하기 쉽습니다. 이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 더욱 향상시켰습니다. 단백질-리간드 상호작용은 단백질 용해 곡선과 용량 의존 곡선의 두 가지 곡선으로 플롯될 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜의 설립을위한 예시 사례로 mTOR- 라파마이신 상호 작용을 사용했다. 프로테올리화 곡선으로부터 우리는 pronase에 의한 mTOR의 프로테오리시스가 라파마이신의 존재에 의해 억제되었다는 것을 보았다. 용량 의존성 곡선은 라파마이신 및 mTOR의 결합 친화성을 추정할 수 있게 해 주었으며, 이를 통해 우리는 라파마이신및 mTOR의 결합친화도를 추정할 수 있게 하였다. 이 방법은 신규표적 단백질을 정확하게 식별하고 약물 표적 참여의 최적화를 위한 강력하고 간단한 방법이 될 가능성이 높습니다.
Introduction
소분자 표적 단백질을 식별하는 것은 잠재적인 치료 약물의 기계학적이해 및 개발에 필수적이다 1,2,3. 친화성 크로마토그래피는 소분자의 표적 단백질을 식별하는 고전적인 방법으로서, 좋은결과를4,5. 그러나, 이 방법은 소분자의 화학적 변형이 종종 감소되거나 변형된 결합 특이성 또는 친화도를 초래한다는 점에서 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 몇몇 새로운 전략은 최근에 작은 분자의 화학적 변형 없이 작은 분자 표적을 확인하기 위하여 개발되고 적용되었습니다. 라벨없는 소분자의 표적 식별을 위한 이러한 직접적인 방법은 약물 친화성반응형 표적 안정성(DARTS) 6, 산화율(SPROX)7,세포열시프션 분석법(CETSA) 8을 포함한다. ,9, 및 열 프로테오메 프로파일링 (TPP)10. 이들 방법은 자연적이고 수정되지 않은 소분자를 사용하고 표적 단백질(11)을찾기 위해 직접 결합 상호작용에만 의존하기 때문에 매우 유리하다.
이러한 새로운 방법 중, DARTS는 대부분의 실험실에서 쉽게 채택 할 수있는 비교적 간단한 방법론이다12,13. DARTS는 리간드 결합 단백질이 언바운드 단백질에 비해 효소 분해에 대한 변형된 감수성을 입증한다는 개념에 의존합니다. 새로운 표적 단백질은 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LC-MS/MS)을 통해 SDS-PAGE 젤의 변경된 밴드를 검사하여 검출할 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 천연 물 및 약물의 이전에 알려지지 않은 대상의 식별을 위해 구현되었습니다14,15,16,17,18, 19. 또한 특정 단백질20,21에화합물의 결합을 스크리크 또는 검증하는 수단으로강력하다. 본 연구에서는, 우리는 작은 분자를 가진 단백질 안정성에 있는 변경을 감시하고 단백질 리간드 결합 친화도를 확인하 여 실험에 개선을 제시합니다. 우리는 우리의 접근을 설명하기 위하여 보기로 mTOR- rapamycin 상호 작용을 이용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTS는 열화에 대한 단백질 결합의 보호 효과를 이타함으로써 작은 분자 표적을 식별할 수 있습니다. DARTS는 소분자(26)의 어떠한 화학적 변형 이나 고정을 필요로 하지 않는다. 이것은 작은 분자가 그들의 직접적인 결합 단백질 표적을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고전 DARTS 방법에 대한 표준 평가 기준은 겔 염색, 질량 분석 법 및 서부 블로팅12,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 연구 보조금 R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, 및 DOD 연구 보조금 W81XWH-16-1-0482에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
Riferimenti
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
