En semi-kvantitativ narkotika affinitet responsiv Target stabilitet (dart)-analysen for å studere Rapamycin/mTOR interaksjon
Summary
I denne studien har vi forbedret Dataanalysefunksjonene i dart-eksperimentet ved å overvåke endringene i protein stabiliteten og estimere affinitet til protein ligand interaksjoner. Samspillet kan tegnes inn i to kurver: en proteolytiske kurve og en dose-avhengighet kurve. Vi har brukt mTOR-Rapamycin interaksjon som en eksemplarisk sak.
Abstract
Drug affinitet responsive Target stabilitet (dart) er en robust metode for påvisning av romanen små molekyl protein mål. Den kan brukes til å verifisere kjente små molekyl-protein interaksjoner og å finne potensielle protein mål for naturlige produkter. Sammenlignet med andre metoder, bruker dart native, uendret, små molekyler og er enkel og lett å betjene. I denne studien forbedret vi ytterligere Dataanalysefunksjonene i dart-eksperimentet ved å overvåke endringene i protein stabiliteten og estimere affinitet av protein-ligand interaksjoner. Den protein-ligand interaksjoner kan tegnes inn i to kurver: en proteolytiske kurve og en dose-avhengighet kurve. Vi har brukt mTOR-Rapamycin interaksjon som en eksemplarisk sak for etablering av vår protokoll. Fra proteolytiske kurven så vi at proteinolyse av mTOR ved pronase ble hemmet av tilstedeværelsen av Rapamycin. Den dose-avhengighet kurve tillot oss å anslå bindingen affinitet av Rapamycin og mTOR. Denne metoden vil trolig være en kraftfull og enkel metode for nøyaktig identifisering av romanen mål proteiner og for optimalisering av narkotika målet engasjement.
Introduction
Identifisering av små molekyl mål proteiner er avgjørende for mekanistisk forståelse og utvikling av potensielle terapeutiske legemidler1,2,3. Affinitet kromatografi, som en klassisk metode for å identifisere målet proteiner av små molekyler, har gitt gode resultater4,5. Denne metoden har imidlertid begrensninger, ved at kjemisk modifisering av små molekyler ofte resulterer i redusert eller endret bindende spesifisitet eller affinitet. For å overkomme disse begrensningene har flere nye strategier nylig blitt utviklet og anvendt for å identifisere de små molekyl målene uten kjemisk modifisering av de små molekylene. Disse direkte metodene for identifisering av etikett frie små molekyler inkluderer narkotika affinitet responsiv mål stabilitet (DARTS)6, stabilitet av proteiner fra utbredelsen av OKSIDASJON (SPROX)7, cellulær termisk Skift-analyse (CETSA)8 ,9, og termisk proteom profilering (TPP)10. Disse metodene er svært fordelaktige fordi de bruker naturlige, uendrede små molekyler og bare stole på direkte bindende interaksjoner for å finne mål proteiner11.
Blant disse nye metodene er dart en forholdsvis enkel metodikk som lett kan vedtas av de fleste Labs12,13. DART avhenger av konseptet som ligand-bundet proteiner demonstrere modifisert mottakelighet for enzymatisk degradering i forhold til ubundne proteiner. Det nye mål proteinet kan oppdages ved undersøkelse av det endrede båndet i SDS-side gel gjennom flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC-MS/MS). Denne tilnærmingen har blitt implementert for identifisering av tidligere ukjente mål av naturlige produkter og narkotika14,15,16,17,18, 19. det er også kraftig som et middel til skjermen eller validere binding av forbindelser til et bestemt protein20,21. I denne studien presenterer vi en forbedring av eksperimentet ved å overvåke endringene i protein stabiliteten med små molekyler og identifisere protein-ligand bindende slektskap. Vi bruker mTOR-Rapamycin interaksjon som et eksempel for å demonstrere vår tilnærming.
Protocol
Representative Results
Discussion
DART tillater identifisering av små molekyl mål ved å utnytte den beskyttende effekten av proteinbinding mot degradering. DART krever ingen kjemiske modifikasjoner eller immobilisering av det lille molekylet26. Dette gjør at små molekyler kan brukes til å bestemme deres direkte bindende protein mål. Standard vurderingskriterier for den klassiske dart-metoden inkluderer gel farging, Mass massespektrometri og Western blotting12,13. De…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet dels av NIH forskningsstipend R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, og et DOD forskningsstipend W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
Riferimenti
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
