フェムトセカンドレーザーによる光刺激は、標的細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)シグナル伝達またはミトコンドリアイベントを活性化する
Summary
緊密に焦点を合わせたフェムト秒レーザーは、共焦点顕微鏡に結合することにより、細胞に正確な刺激を提供し、リアルタイムの観察と光刺激を可能にします。光刺激は、ERKシグナル伝達経路および活性酸素種のミトコンドリアフラッシュを含む細胞分子イベントを活性化することができる。
Abstract
細胞定義分子事象の直接制御は生命科学にとって重要である。近年、フェムト秒レーザー刺激が複数の細胞分子シグナル伝達経路を同時に活性化できることが研究で実証されている。このプロトコルでは、フェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合することで、細胞を密に焦点を合わせたレーザーによって正確に刺激できることを示す。同時に観察することができるいくつかの分子プロセスは、その後活性化されます。我々は、ヘラ細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)シグナル伝達経路を活性化するための光刺激の詳細なプロトコルを提示する。活性酸素種(ROS)および他のミトコンドリア事象のミトコンドリアフラッシュは、特定のミトコンドリア管状構造にフェムト秒レーザーパルスを集当すれば刺激することもできる。このプロトコルには、光刺激の前に細胞を前処理し、フェムト秒レーザーフラッシュによる光刺激をターゲットに送り、その後の分子変化を観察/同定することが含まれます。このプロトコルは、関連する生物学的研究のための全光学ツールを表す。
Introduction
細胞シグナル伝達分子を制御する技術は、生命科学の発展の重要な部分です。伝統的に、最も一般的に使用される方法は、薬物または生物学的材料1、2、3による生化学的治療である。過去10年間にわたり、光遺伝学の発明は、細胞分子信号変調のための新しい時代を開きます。遺伝子工学による光感受性タンパク質によるトランスフェクションは、光が標的細胞内の様々なタンパク質活性を調節する強力なツールになります。この技術は、神経信号の励起と阻害、遺伝子発現の促進、細胞信号パターンの操作、異なる細胞の運命と病理学的調査をリードするなどの進歩を奨励しています 4,5 ,6,7,8,9.しかし、光は光遺伝学的タンパク質で細胞をトランスフェクトすることによってのみ働くことができます。現在の段階では、光遺伝学以外に細胞分子を直接制御できる稀な方法があります。
フェムト秒レーザーは、良好な生物学的安全性を維持しながら、効率的なマルチフォトン励起を提供することにより、高度な生物学的研究を持っています。多様な写真処理戦略を展開することで、多光子顕微鏡、顕微鏡検査、多光子光遺伝学アプリケーション10、11、12、13などの多くの成果を実現しています。 ,14,15,16.最近の研究では、フェムト秒レーザー刺激が分子シグナル伝達事象を直接誘導する高効率光学法として実証されている。小プラズム網膜(ER)に対する緊密に焦点を当てたフェムト秒レーザー照射は、ERでカルシウムを枯渇させ、カルシウム放出活性化カルシウム(CRAC)チャネルを活性化して細胞17内でカルシウムシグナルを形成できることが分かった。この光活性化カルシウムシグナルは、複数のタイプの細胞18、19、20の間に広がりうる。さらに、活性T細胞(NFAT)およびERKシグナル伝達経路21、22の核因子などの細胞シグナル伝達経路を活性化する能力も有する。細胞におけるフェムト秒レーザー曝露の強度と局在化を調整することにより、例えば、レーザーをミトコンドリアに集色すると、ミトコンドリア形態および分子事象23、24、および、25.具体的には、ミトコンドリアROS生成のバーストは、ミトコンドリア(ミトフラッシュ)で蛍光点滅として言及されている光刺激によって興奮することができる。
したがって、光刺激技術は、関連する生物学的研究に広く適用される可能性が高い。また、顕微鏡検査以外の細胞シグナル伝達分子や機能の制御においてフェムト秒レーザー用途を拡張する良い機会でもあります。ここでは、光刺激の技術的な詳細を提供します。光刺激は、フェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合し、短いフラッシュ光刺激を持つ単一の標的細胞を提供することによって達成される。それは細胞の有効で、制御可能なERK活動化を開始できる。光刺激がミトコンドリア管状構造上に位置する場合、ミトコンドリア膜電位、形態、ROS、および透過性遷移毛孔は、すべて光刺激によって制御することができる。この光刺激スキームに基づいて、ERKシグナル伝達経路を活性化し、Hela細胞における複数のミトコンドリア事象に影響を与える詳細な方法を提供する。このプロトコルは、フェムト秒レーザー刺激を標的細胞に送り込むプロセスを解明する。
光刺激システムは同時刺激および連続的な顕微鏡のためのフェムト秒レーザー結合が付いている共焦点顕微鏡で確立される。フェムト秒レーザー(波長:1,040nm、繰り返し速度:50MHz、パルス幅:120fs、最大出力平均電力:1W)は、カップリング前に2つのビームに分割されます。一つは、レンズのペアからなる中継望遠鏡を介して導かれます。次に、回折限界焦点(Stim-A)を形成するために、目的の背面開口部(60x、N.A.=1.2、水浸漬)に直接反射されます。もう一つは、2光子走査モード(Stim-B)として機能する共焦点顕微鏡の走査光学経路に反映される。スティム A は、視野の中心 (FOV) に固定フォーカス ポイントを表示します。Stim-BはFOVであらかじめ設計された部分共焦点スキャン領域である。図 1A にスティム A とスティム B を示します。ダイクロイックミラー(DM)の下のCCDカメラは、フェムト秒レーザーの焦点を監視するための明視野イメージングを提供します。
以下の実験には重要な要素がいくつかあります。このプロトコルでは、フェムト秒ファイバーレーザー光源(1040nm、50MHz、120fs)を例に用いられる。実際には、ほとんどの市販のフェムト秒発振器は、パルス幅が200fsより短く、ピーク電力密度が1011~10 12 W/cm2のレベルを超える必要がある限り使用できます。例えば、Ti:サファイアレーザーは、通常、多光子顕微鏡検査に使用され、図1Bに示すフェムト秒レーザーを置き換えることができる。光学パラメータ(パルス幅、波長、繰り返し速度)は異なるフェムト秒レーザーで大きく異なるため、レーザーパワーやその他の光刺激パラメータは調整する必要があります。
フェムト秒レーザー刺激と共に、共焦点顕微鏡は、スティムAおよびスティムBモードの両方でリアルタイムで分子ダイナミクスを監視する連続的な細胞イメージングを提供します。両方の光刺激方式(Stim-AおよびStim-B)はミリ秒の解像度を持つメカニカルシャッターによって制御される(図1)。
スティムAモードでは、レーザーフォーカスの位置はFOVの中心に固定されます。中継望遠鏡は、2つのレンズ間を垂直方向に調整することにより、フェムト秒レーザーの焦点を高焦点に保つために使用されます(レーザー伝搬方向、共焦点イメージング平面への垂直方向) 図1)CCDカメラの明視野イメージングにより、レーザーフォーカスの直径を測定することができます(約2μm、図2B)。刺激時間および露出時間は共焦点イメージ投射プロセスの間にシャッターによって制御される。
Stim-B モードでは、刺激領域は、共焦点イメージング制御ソフトウェアで、ライン、ポリゴン、または円などの任意の形式に手動で割り当てることができます。シャッターは共焦点スキャンプロセスと同期されます。これは、共焦点イメージング制御ソフトウェアを介して設定された事前に設計された時間に開きます。次いで、刺激領域を共焦点顕微鏡としてフェムト秒レーザーでスキャンする。したがって、試料は、共焦点走査処理が所定の撮像フレームに入るときにのみフェムト秒レーザーによって刺激される。
光刺激システムは、実験対象に応じて反転および直立冶金顕微鏡の両方で確立することができる。ペトリ皿で培養されたインビトロ細胞は、反転顕微鏡で作業する方が良いです。動物、特に生きた動物の脳は、直立顕微鏡でより適しています。本研究では、反転顕微鏡を例にとった。ペトリ皿のカバーは、全体の実験中に開かれていないことに留意すべきです。
Protocol
Representative Results
Discussion
フェムト秒レーザーとレーザー走査共焦点顕微鏡システムを組み合わせることで光刺激戦略を実証する。光刺激は、それに応じてStim-Bを定義することにより、2光子顕微鏡として直接働くことができる。我々は、ターゲット細胞におけるERKシグナル伝達またはミトフラッシュを引き起こすためにフェムト秒レーザーの短いフラッシュを利用するための詳細なプロトコルを提供する。異なる刺激…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(81571719および81661168014、81673014、81870055)、上海市科学技術委員会(18QA14023000および16XD1403100)、および国家キーR&プランD00000によって支援されました。
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
Riferimenti
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