Femtosecond लेजर द्वारा फोटोउत्तेजना अतिरिक्त सेल्यूलर-संकेत विनियमित Kinase (ERK) संकेतया लक्ष्य कोशिकाओं में Mitochondrial घटनाक्रम सक्रिय करता है
Summary
कसकर केंद्रित femtosecond लेजर वास्तविक समय अवलोकन और photostimulation को सक्षम करने के लिए एक confocal माइक्रोस्कोपी में युग्मित किया जा रहा द्वारा कोशिकाओं के लिए सटीक उत्तेजना वितरित कर सकते हैं. photostimulation ERK संकेतन मार्ग और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के mitochondrial चमक सहित सेल आणविक घटनाओं को सक्रिय कर सकते हैं.
Abstract
सेलुलर परिभाषित आणविक घटनाओं का प्रत्यक्ष नियंत्रण जीवन विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है. हाल ही में, अध्ययनों से पता चला है कि femtosecond लेजर उत्तेजना एक साथ कई सेलुलर आणविक संकेतन रास्ते सक्रिय कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि एक confocal माइक्रोस्कोप में युग्मन femtosecond लेजर के माध्यम से, कोशिकाओं को कसकर केंद्रित लेजर द्वारा ठीक प्रेरित किया जा सकता है. कुछ आण्विक प्रक्रम जिन्हें एक साथ देखा जा सकता है, बाद में सक्रिय हो जाते हैं। हम hela कोशिकाओं में extracellular संकेत विनियमित kinase (ERK) संकेतन मार्ग को सक्रिय करने के लिए photostimulation के विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के Mitochondrial चमक (आरओएस) और अन्य mitochondrial घटनाओं भी प्रेरित किया जा सकता है अगर एक निश्चित mitochondrial ट्यूबलर संरचना पर femtosecond लेजर नाड़ी ध्यान केंद्रित. इस प्रोटोकॉल photostimulation से पहले कोशिकाओं pretreating भी शामिल है, लक्ष्य पर एक femtosecond लेजर फ्लैश द्वारा photostimulation देने, और देख / इस प्रोटोकॉल संबंधित जैविक शोध के लिए एक सभी ऑप्टिकल उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.
Introduction
सेलुलर संकेतन अणुओं को नियंत्रित करने की तकनीक जीवन विज्ञान के विकास का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है. परंपरागत रूप से, सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधिदवाओं या जैविक सामग्री 1 ,2,3द्वारा जैव रासायनिक उपचार है। पिछले दशक में, optogenetics के आविष्कार सेलुलर आणविक संकेत मॉडुलन के लिए एक नए युग को खोलता है. जीन इंजीनियरिंग द्वारा प्रकाश संवेदनशील प्रोटीन के साथ संक्रमण प्रकाश लक्ष्य सेल में विभिन्न प्रोटीन गतिविधियों को मॉड्युलेट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन जाता है। इस प्रौद्योगिकी ने उत्तेजना और तंत्रिका संकेत के निषेध, जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने, सेलुलर संकेत पैटर्न मेंहेरफेर, विभिन्न सेल भाग्य और पैथोलॉजिकल जांच 4, 5 के रूप में उत्साहजनक प्रगति की है 6,7,8,9. हालांकि, प्रकाश केवल optogenetic प्रोटीन के साथ कोशिकाओं transfecting द्वारा काम कर सकते हैं. वर्तमान अवस्था में, वहाँ दुर्लभ तरीके है कि प्रकाश optogenetics के अलावा सीधे सेलुलर अणुओं को नियंत्रित करने के लिए सक्षम मौजूद हैं.
Femtosecond लेजर कुशल multiphoton उत्तेजना प्रदान करते हुए अच्छा जैविक सुरक्षा बनाए रखने के द्वारा उन्नत जैविक शोध किया है. विविध फोटो प्रसंस्करण रणनीतियों की तैनाती करके, यह इस तरह के multiphoton माइक्रोस्कोपी, microsurgeries और multiphoton optogenetic अनुप्रयोगों10,11,12,13 के रूप में कई उपलब्धियों का एहसास हुआ है ,14,15,16. हाल की जांच से पता चलता है कि femtosecond लेजर उत्तेजना एक अत्यधिक कुशल ऑप्टिकल विधि के रूप में प्रदर्शन किया गया है सीधे आणविक संकेतन घटनाओं प्रेरित. यह पाया गया है कि एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) पर कसकर केंद्रित फेमटोसेकंड लेजर विकिरण ईआर में कैल्शियम को कम करनेऔर कोशिकाओं में कैल्शियम संकेतों के रूप में कैल्शियम रिलीज-सक्रिय कैल्शियम (सीआरएसी) चैनलों को सक्रिय करने में सक्षम है। यह फोटो सक्रिय कैल्शियम संकेत कोशिकाओं के कई प्रकार के बीच फैल सकता है18,19,20. इसके अलावा, यह भी सक्रिय टी कोशिकाओं के परमाणु कारक के रूप में सेल संकेतन रास्ते को सक्रिय करने की क्षमता है (NFAT) और ERK संकेतन मार्ग21,22. तीव्रता और कोशिकाओं में femtosecond लेजर जोखिम के स्थानीयकरण का समायोजन करके, उदाहरण के लिए, mitochondria पर लेजर ध्यान केंद्रित, यह mitochondrial आकारिकी और आणविक घटनाओं को प्रभावित कर सकते हैं23,24, 25.विशेष रूप से, mitochondrial ROS पीढ़ी के फटने photostimulation द्वारा उत्साहित किया जा सकता है, जो mitochondria (mitoflashes) में फ्लोरोसेंट चमक के रूप में टिप्पणी की है.
इसलिए, photostimulation प्रौद्योगिकी अच्छी क्षमता के लिए व्यापक रूप से संबंधित जैविक अनुसंधान में लागू किया जा सकता है. यह भी सेलुलर संकेत अणुओं और माइक्रोस्कोपी के अलावा कार्यों को नियंत्रित करने में femtosecond लेजर अनुप्रयोगों का विस्तार करने के लिए एक अच्छा मौका है. यहाँ, हम photostimulation के तकनीकी विवरण प्रदान करते हैं. photostimulation एक कम flashphotostimulation के साथ एकल लक्ष्य सेल प्रदान करने के लिए एक confocal माइक्रोस्कोप के लिए एक femtosecond लेजर युग्मन द्वारा हासिल की है. यह सेल में कुशल और नियंत्रणीय ERK सक्रियण आरंभ कर सकते हैं. यदि photostimulation mitochondrial ट्यूबलर संरचना पर स्थित है, mitochondrial झिल्ली क्षमता, आकृति विज्ञान, ROS, और पारगम्यता संक्रमण pores, सभी photostimulation द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. इस photostimulation योजना के आधार पर, हम ERK संकेतन मार्ग को सक्रिय करने और हेला कोशिकाओं में कई mitochondrial घटनाओं को प्रभावित करने की एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल लक्ष्य कोशिकाओं में femtosecond लेजर उत्तेजना देने की प्रक्रिया elucidates.
photostimulation प्रणाली एक साथ उत्तेजना और निरंतर माइक्रोस्कोपी के लिए यह में एक femtosecond लेजर युग्मन के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप पर स्थापित किया गया है. femtosecond लेजर (तरंग लंबाई: 1,040 एनएम, पुनरावृत्ति दर: 50 मेगाहर्ट्ज, पल्स चौड़ाई: 120 fs, अधिकतम उत्पादन औसत शक्ति: 1 डब्ल्यू) युग्मन से पहले दो बीम में विभाजित है. एक लेंस की एक जोड़ी से मिलकर एक रिले दूरबीन के माध्यम से निर्देशित है. यह तो सीधे एक विवर्तन सीमा फोकस (Stim-A) बनाने के लिए एक उद्देश्य (60x, N.A. $ 1.2, पानी विसर्जन) के पीछे एपर्चर में परिलक्षित होता है। अन्य एक दो-फोटोन स्कैनिंग मोड (Stim-B) के रूप में काम करने के लिए confocal माइक्रोस्कोप की स्कैनिंग ऑप्टिकल पथ को परिलक्षित होता है। Stim-A दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में एक निश्चित फोकस बिंदु प्रस्तुत करता है (FOV). Stim-B FOV में एक पूर्व डिजाइन आंशिक confocal स्कैनिंग क्षेत्र है. Stim-A और Stim-B चित्र 1Aमें दिखाए गए हैं। dichroic दर्पण (डीएम) के तहत एक सीसीडी कैमरा femtosecond लेजर के ध्यान की निगरानी के लिए उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग प्रदान करता है.
निम्नलिखित प्रयोगों के लिए कुछ महत्वपूर्ण अनिवार्य हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक femtosecond फाइबर लेजर स्रोत (1040 एनएम, 50 मेगाहर्ट्ज, 120 fs) एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. व्यवहार में, अधिकांश वाणिज्यिक फेमोसेकंड oscillators के रूप में लंबे समय के रूप में पल्स चौड़ाई 200 fs से कम है और चोटी शक्ति घनत्व 1011 के स्तर से ऊपर होना चाहिए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता 1012 W/cm2. उदाहरण के लिए, एक ती: नीलम लेजर आमतौर पर multiphoton माइक्रोस्कोपी के लिए प्रयोग किया जाता है femtosecond लेजर चित्र 1Bमें दिखाया की जगह करने में सक्षम है. लेजर शक्ति और कुछ अन्य photostimulation मापदंडों क्योंकि ऑप्टिकल मापदंडों (पल्स चौड़ाई, तरंगदैर्ध्य, और पुनरावृत्ति दर) विभिन्न femtosecond लेज़रों में एक बहुत भिन्न है कि इस प्रकार विभिन्न multiphoton उत्तेजना क्षमता प्रेरित tuned होने की जरूरत है.
femtosecond लेजर उत्तेजना के साथ, confocal माइक्रोस्कोपी दोनों Stim-A और Stim-B मोड में वास्तविक समय में आणविक गतिशीलता पर नजर रखने के लिए निरंतर सेल इमेजिंग प्रदान करता है। दोनों photostimulation योजनाओं (Stim-A और Stim-B) millisecond संकल्प के साथ एक यांत्रिक शटर द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं (चित्र 1).
Stim-एक मोड में, लेजर फोकस की स्थिति FOV के केंद्र में तय हो गई है. एक रिले दूरबीन femtosecond लेजर का ध्यान सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है confocal इमेजिंग विमान पर ऊर्ध्वाधर दिशा में दो लेंस के बीच की दूरी ट्यूनिंग द्वारा स्थित हो (लेजर प्रचार दिशा, confocal इमेजिंग विमान के लिए ऊर्ध्वाधर, के रूप में में दिखाया गया है चित्र 1) . सीसीडी कैमरे के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग द्वारा, लेजर फोकस का व्यास मापा जा सकता है ($2 $m, चित्रा 2B). उत्तेजना durations और जोखिम बार confocal इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान एक शटर द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं.
Stim-B मोड में, उत्तेजना क्षेत्र को शंखाकार इमेजिंग नियंत्रण सॉफ्टवेयर में लाइन, बहुभुज, या वृत्त जैसे किसी भी रूप में मैन्युअल रूप से पूर्व-असाइन किया जा सकता है. शटर confocal स्कैनिंग प्रक्रिया के साथ सिंक्रनाइज़ है. यह पूर्व डिजाइन समय जो confocal इमेजिंग नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से सेट किया जाता है पर खुलता है. फिर, उत्तेजना क्षेत्र confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में femtosecond लेजर द्वारा स्कैन किया जाता है. इस प्रकार, नमूना केवल femtosecond लेजर द्वारा प्रेरित है जब confocal स्कैनिंग प्रक्रिया एक दिया इमेजिंग फ्रेम में प्रवेश करती है.
प्रयोग विषयों के अनुसार उल्टे और ईमानदार धातुकर्मीय सूक्ष्मदर्शी दोनों पर प्रकाशउद्रूपक प्रणाली स्थापित की जा सकती है। इन विट्रो कोशिकाओं में पेट्री व्यंजन में सुसंस्कृत उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ काम करने के लिए बेहतर कर रहे हैं। पशु, विशेष रूप से जीवित जानवरों के दिमाग, ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ अधिक उपयुक्त हैं। इस अध्ययन में हम उल्टे सूक्ष्मदर्शी को एक उदाहरण के रूप में लेते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पेट्री डिश का कवर पूरे प्रयोगों के दौरान नहीं खोला जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ एक femtosecond लेजर के संयोजन के द्वारा एक photostimulation रणनीति का प्रदर्शन. photostimulation सीधे Stim-B तदनुसार परिभाषित करके एक दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी के रूप में काम कर सकते ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81571719 और 81661168014, 81673014, और 81870055), शंघाई नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी समिति (18QA1402300 और 16XD1403100) और राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी योजना (2017) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
Riferimenti
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
- Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
- Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson’s disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
- Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
- Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
- He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
- Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
- Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
- He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
- Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
- Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
- Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
- Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
- Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).
- Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
- Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).
