Fotoestimulación por láser de femtosegundo activa la señalización de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) o eventos mitocondriales en células objetivo
Summary
El láser de femtosegundo sin enfoque puede proporcionar una estimulación precisa a las células al acoplarse en una microscopía confocal que permite la observación en tiempo real y la fotoestimulación. La fotoestimulación puede activar eventos moleculares celulares, incluyendo la vía de señalización ERK y destellos mitocondriales de especies reactivas de oxígeno.
Abstract
El control directo de los eventos moleculares definidos celulares es importante para las ciencias de la vida. Recientemente, los estudios han demostrado que la estimulación láser de femtosegundo puede activar simultáneamente múltiples vías de señalización molecular celular. En este protocolo, mostramos que a través del acoplamiento del láser de femtosegundo en un microscopio confocal, las células pueden ser estimuladas con precisión por el láser estrechamente enfocado. Algunos procesos moleculares que se pueden observar simultáneamente se activan posteriormente. Presentamos protocolos detallados de la fotoestimulación para activar la vía de señalización de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) en las células de Hela. Los destellos mitocondriales de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otros eventos mitocondriales también se pueden estimular si se centra el pulso láser de femtosegundo en una determinada estructura tubular mitocondrial. Este protocolo incluye pretratar las células antes de la fotoestimulación, entregar la fotoestimulación mediante un destello láser de femtosegundo en el objetivo, y observar /identificar los cambios moleculares después. Este protocolo representa una herramienta totodológica para investigaciones biológicas relacionadas.
Introduction
La tecnología de control de moléculas de señalización celular es una parte importante del desarrollo de la ciencia de la vida. Tradicionalmente, el método más utilizado es el tratamiento bioquímico por fármacos o materiales biológicos1,2,3. Durante la última década, la invención de la optogenética abre una nueva era para la modulación de la señal molecular celular. La transfección con proteínas sensibles a la luz por la ingeniería génica hace que la luz se convierta en una poderosa herramienta para modular diversas actividades proteicas en la célula diana. Esta tecnología ha hecho progresos alentadores como la excitación e inhibición de la señal neuronal, la promoción de la expresión génica, la manipulación de patrones de señal celular, la conducción de diferentes destinos celulares y la investigación patológica4,5 ,6,7,8,9. Sin embargo, la luz sólo puede funcionar transfectando células con proteínas optogenéticas. En la etapa actual, existen métodos raros que permiten a la luz controlar las moléculas celulares directamente además de la optogenética.
El láser Femtosecond ha avanzado en investigaciones biológicas al proporcionar una excitación multifozona eficiente mientras mantiene una buena seguridad biológica. Mediante el despliegue de diversas estrategias de procesamiento fotográfico, ha logrado numerosos logros como microscopía multifotona, microcirugías y aplicaciones optogenéticas multifotones10,11,12,13 ,14,15,16. Investigaciones recientes muestran que la estimulación láser de femtosegundo se ha demostrado como un método óptico altamente eficiente para inducir directamente eventos de señalización molecular. Se ha encontrado que la irradiación láser de femtosegundo fuertemente enfocada en el retículo endoplasmático (ER) es capaz de agotar el calcio en ER y activar los canales de calcio activado por liberación de calcio (CRAC) para formar señales de calcio en las células17. Esta señal de calcio fotoactivada puede propagarse entre múltiples tipos de células18,19,20. Además, también tiene la capacidad de activar vías de señalización celular como el factor nuclear de las células T activadas (NFAT) y la vía de señalización ERK21,22. Al ajustar la intensidad y localización de la exposición láser de femtosegundo en las células, por ejemplo, enfocando el láser en las mitocondrias, puede influir en la morfología mitocondrial y los eventos moleculares23,24, 25. Específicamente, las ráfagas de generación de ROS mitocondrial pueden excitarse mediante la fotoestimulación, que se comenta como destellos fluorescentes en las mitocondrias (mitoflashes).
Por lo tanto, la tecnología de fotoestimulación es de buen potencial para ser ampliamente aplicada en la investigación biológica relacionada. También es una buena oportunidad para extender las aplicaciones láser de femtosegundo en el control de moléculas de señalización celular y funciones además de la microscopía. Aquí, proporcionamos los detalles técnicos de la fotoestimulación. La fotoestimulación se logra acoplando un láser de femtosegundo a un microscopio confocal para proporcionar una sola célula diana con una fotoestimulación flash corta. Puede iniciar la activación ERK eficiente y controlable en la célula. Si la fotoestimulación se encuentra en la estructura tubular mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, la morfología, el ROS y los poros de transición permeabilidad, pueden ser controlados por la fotoestimulación. Basándonos en este esquema de fotoestimulación, proporcionamos un método detallado para activar la vía de señalización ERK e influir en múltiples eventos mitocondriales en las células de Hela. Este protocolo aclara el proceso de entrega de estimulación láser de femtosegundo en las células diana.
El sistema de fotoestimulación se establece en un microscopio confocal con un acoplamiento láser de femtosegundo en él para la estimulación simultánea y la microscopía continua. El láser de femtosegundo (longitud de onda: 1.040 nm, velocidad de repetición: 50 MHz, ancho de pulso: 120 fs, potencia media de salida máxima: 1 W) se divide en dos haces antes del acoplamiento. Uno es guiado a través de un telescopio de relé que consiste en un par de lentes. A continuación, se refleja directamente en la apertura posterior de un objetivo (60x, N.A. a 1.2, inmersión en agua) para formar un enfoque de límite de difracción (Stim-A). El otro se refleja en la trayectoria óptica de escaneo del microscopio confocal para funcionar como un modo de escaneo de dos fotones (Stim-B). Stim-A presenta un punto de enfoque fijo en el centro del campo de visión (FOV). Stim-B es un área de escaneo confocal parcial prediseñada en el FOV. Stim-A y Stim-B se muestran en la Figura 1A. Una cámara CCD bajo el espejo dicroico (DM) proporciona imágenes de campo brillante para monitorear el enfoque del láser de femtosegundo.
Hay algunos elementos esenciales cruciales para los siguientes experimentos. En este protocolo, se utiliza como ejemplo una fuente láser de fibra de femtosegundo (1040 nm, 50 MHz, 120 fs). En la práctica, la mayoría de los osciladores de femtosegundos comerciales se pueden utilizar siempre y cuando el ancho del pulso sea inferior a 200 fs y la densidad de potencia máxima debe estar por encima del nivel de 1011 x 1012 W/cm2. Por ejemplo, un láser Ti: Sapphire que se utiliza generalmente para la microscopía multifotón es capaz de reemplazar el láser de femtosegundo mostrado en la Figura 1B. La potencia del láser y algunos otros parámetros de fotoestimulación necesitan ser ajustados porque los parámetros ópticos (ancho de pulso, longitud de onda y tasa de repetición) varían mucho en diferentes láseres de femtosegundos que por lo tanto inducen diferentes eficiencias de excitación multifotón.
Junto con la estimulación láser de femtosegundo, la microscopía confocal proporciona imágenes celulares continuas para monitorear la dinámica molecular en tiempo real en los modos Stim-A y Stim-B. Ambos esquemas de fotoestimulación (Stim-A y Stim-B) son controlados por un obturador mecánico con resolución de milisegundos (Figura1).
En el modo Stim-A, la posición del enfoque láser se fija en el centro de FOV. Un telescopio de relé se utiliza para asegurar el enfoque del láser de femtosegundo que se ubicará en el plano de imagen confocal ajustando la distancia entre dos lentes en la dirección vertical (la dirección de propagación láser, vertical al plano de imagen confocal, como se muestra en Figura 1). Por las imágenes de campo brillante de la cámara CCD, se puede medir el diámetro del enfoque láser (2 m, Figura 2B). Las duraciones de estimulación y los tiempos de exposición son controlados por un obturador durante el proceso de imagen confocal.
En el modo Stim-B, el área de estimulación se puede preasignar manualmente en el software de control de imágenes confocales a cualquier forma como línea, polígono o círculo. El obturador se sincroniza con el proceso de escaneo confocal. Se abre a la hora prediseñada que se establece a través del software de control de imágenes confocales. A continuación, el área de estimulación es escaneada por láser de femtosegundo como microscopía confocal. Por lo tanto, la muestra sólo es estimulada por láser de femtosegundo cuando el proceso de escaneo confocal entra en un marco de imagen dado.
El sistema de fotoestimulación se puede establecer en microscopios metalúrgicos invertidos y verticales según los sujetos del experimento. Las células in vitro cultivadas en platos Petri son mejores para trabajar con microscopios invertidos. Los animales, especialmente los cerebros de animales vivos, son más adecuados con microscopios verticales. En este estudio, tomamos el microscopio invertido como ejemplo. Cabe señalar que la cubierta de la placa Petri no se abre durante todos los experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demostramos una estrategia de fotoestimulación combinando un láser de femtosegundo con un sistema de microscopio confocal de escaneo láser. La fotoestimulación puede funcionar directamente como una microscopía de dos fotones definiendo Stim-B en consecuencia. Proporcionamos un protocolo detallado para utilizar un breve flash de láser de femtosegundo para activar la señalización ERK o mitoflashes en las células objetivo. Los diferentes modos de estimulación se pueden realizar de acuerdo con diferentes propósito…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81571719 y 81661168014, 81673014 y 81870055), el Comité Municipal de Ciencia y Tecnología de Shanghái (18QA1402300 y 16XD1403100), y el Plan Nacional de I+D clave (2017YFA0100).
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
Riferimenti
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