Photostimulation av Femtosecond laser aktiverar extracellulär-signalreglerade Kinas (ERK) signalering eller mitokondriella händelser i målceller
Summary
Tätt fokuserad femtosecondlaser laser kan leverera exakt stimulering till celler genom att kopplas till en konfokal mikroskopi möjliggör realtid observation och photostimulation. Den photostimulation kan aktivera cell molekylära händelser inklusive ERK signalering väg och mitokondriella blixtar av reaktiva syreradikaler.
Abstract
Direkt kontroll av cellulär definierade molekylära händelser är viktigt för Life Science. Nyligen, studier har visat att femtosecondlaser laserstimulering kan samtidigt aktivera flera cellulära molekylära signalvägar. I detta protokoll visar vi att genom att koppla femtosecondlaser laser till ett konfokalmikroskop kan celler stimuleras just av den tätt fokuserade lasern. Vissa molekylära processer som kan observeras samtidigt aktiveras därefter. Vi presenterar detaljerade protokoll för photostimulation att aktivera extracellulär signal reglerade Kinas (ERK) signalering väg i hela celler. Mitokondriella blixtar av reaktiva syreradikaler (ROS) och andra mitokondriella händelser kan också stimuleras om att fokusera femtosecondlaser laserpuls på en viss mitokondriell tubulär struktur. Detta protokoll innehåller förbehandling celler före photostimulation, leverera photostimulation av en femtosecondlaser laser blixt på målet, och observation/identifiera molekylära förändringar efteråt. Detta protokoll representerar ett helt optiskt verktyg för relaterade biologiska undersökningar.
Introduction
Tekniken för att kontrollera cellulära signalmolekyler är en viktig del av utvecklingen av Life Science. Traditionellt, den mest använda metoden är biokemisk behandling av droger eller biologiska material1,2,3. Under det senaste decenniet öppnar uppfinningen av optogenetik en ny era för cellulära molekylära signal modulering. Transfektion med ljuskänsliga proteiner genom genteknik gör att ljus blir ett kraftfullt verktyg för att modulera olika protein aktiviteter i målcellen. Denna teknik har gjort uppmuntrande framsteg såsom excitation och hämning av neurala signal, främja genuttryck, manipulera cellulära signal mönster, ledande olika cell öden och patologisk utredning4,5 ,6,7,8,9. Men ljus kan bara fungera genom att transfecting celler med optogenetiska proteiner. I nuvarande skede finns det sällsynta metoder som gör det möjligt för ljus att kontrollera cellulära molekyler direkt förutom optogenetik.
Femtosecond laser har avancerade biologiska undersökningar genom att ge effektiv multiphoton excitation samtidigt bibehålla god biologisk säkerhet. Genom att distribuera olika strategier Foto bearbetning, har det insett många prestationer såsom multiphoton mikroskopi, microsurgeries och multiphoton optogenetiska tillämpningar10,11,12,13 ,14,15,16. Nyligen undersökningar visar att femtosecondlaser laserstimulering har visats som en mycket effektiv optisk metod för att direkt inducera molekylära signal händelser. Det har visat sig att tätt fokuserad femtosecondlaser laser bestrålning på endoplasmatiska Retikulum (ER) kan tömma kalcium i ER och aktivera kalcium-release-aktiverade kalcium (CRAC) kanaler för att bilda kalcium signaler i celler17. Denna fotoaktiverade kalcium signal kan spridas mellan olika typer av celler18,19,20. Dessutom, det har också förmågan att aktivera cell signalering vägar såsom nukleär faktor aktiverade T-celler (NFAT) och erk signalering väg21,22. Genom att justera intensitet och lokalisering av femtosecondlaser laser exponering i celler, till exempel, att fokusera lasern på mitokondrien, det kan påverka mitokondriell morfologi och molekylära händelser23,24, 25. specifikt, utbrott av mitokondriell ros generation kan vara upphetsad av photostimulation, som är märkt som fluorescerande blixtar i mitokonan (mitoblixtar).
Därför är fotostimuleringstekniken av god potential att allmänt tillämpas i relaterad biologisk forskning. Det är också en god chans att förlänga femtosecondlaser laserapplikationer i kontroll av cellulära signalmolekyler och funktioner förutom mikroskopi. Här ger vi de tekniska detaljerna i photostimulation. Den photostimulation uppnås genom att koppla en femtosecondlaser laser till ett konfokala Mikroskop för att ge enda målcellen med en kort blixt photostimulation. Det kan initiera effektiv och kontrollerbar ERK aktivering i cellen. Om photostimulation ligger på mitokondriell tubulär struktur, mitokondriella membranet potential, morfologi, ROS, och permeabilitet övergången porer, kan alla styras av photostimulation. Baserat på denna photostimulation system, ger vi en detaljerad metod för att aktivera ERK signalering väg och påverka flera mitokondriella händelser i hela celler. Detta protokoll belyser processen för att leverera femtosecondlaser laserstimulering till målceller.
Photostimulation systemet är etablerat på ett konfokala Mikroskop med en femtosecondlaser laser koppling i den för samtidig stimulering och kontinuerlig mikroskopi. Den femtosecondlaser laser (våglängd: 1 040 nm, repetitionshastighet: 50 MHz, pulsbredd: 120 FS, maximal effekt genomsnittlig effekt: 1 W) är uppdelad i två balkar innan kopplingen. En styrs genom ett relä teleskop som består av ett par linser. Det återspeglas sedan direkt i back-bländare av ett mål (60x, N.A. = 1,2, vatten nedsänkning) att bilda en diffraktion-Limit fokus (Stim-A). Den andra reflekteras till scanning optiska vägen av konfokalmikroskopi Mikroskop att arbeta som en två-Photon scanning mode (Stim-B). Stim-A presenterar en fast fokuspunkt i mitten av synfält (FOV). Stim-B är en fördesignad partiell konfokal scanning område i FOV. Stim-A och stim-B visas i figur 1a. En CCD-kamera under Dichroic Mirror (DM) ger ljus-fält Imaging för övervakning i fokus för femtosecondlaser laser.
Det finns några viktiga nödvändigheter för följande experiment. I detta protokoll används en femtosecondlaser fiber laserkälla (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) som ett exempel. I praktiken kan de flesta kommersiella femtosecondlaser oscillatorer användas så länge pulsen bredden är kortare än 200 FS och toppeffekt tätheten bör vara över nivån på 1011 ~ 1012 W/cm2. Till exempel, en TI: Sapphire laser som vanligtvis används för multiphoton mikroskopi kan ersätta den femtosecondlaser lasern visade i figur 1b. Lasern makt och några andra photostimulation parametrar måste trimmas eftersom de optiska parametrarna (pulsbredd, våglängd, och upprepning hastighet) varierar mycket i olika femtosecondlaser lasrar som därmed inducera olika multiphoton excitation effektivitetsvinster.
Tillsammans med femtosecondlaser laserstimulering ger konfokalmikroskopi kontinuerlig cell avbildning för att övervaka molekylär dynamik i realtid i både Stim-A och stim-B-lägena. Båda fotostimuleringsscheman (Stim-A och stim-B) styrs av en mekanisk slutare med millisekunders upplösning (figur 1).
I stim-A-läge, är placeringen av laser fokus fast i mitten av FOV. Ett relä teleskop används för att säkerställa fokus för femtosecondlaser laser ska placeras på konfokalmikroskopi Imaging planet genom att trimma avståndet mellan två linser i vertikal riktning (laser spridnings riktningen, vertikal till konfokala avbildning planet, som visas i Figur 1). Vid Bright-Field avbildning av CCD-kamera, kan diametern på laser fokus mätas (~ 2 μm, figur 2b). Stimuleringens varaktigheter och exponeringstider styrs av en slutare under den konfokala avbildningsprocessen.
I stim-B-läget kan stimuleringsområdet förhandstilldelas manuellt i konfokalmikroskopi Imaging kontrollerande programvara till någon form som linje, polygon eller cirkel. Slutaren synkroniseras med den konfokala skanningsprocessen. Det öppnar på pre-designade tid som är inställd genom konfokalmikroskopi Imaging kontrollerande programvara. Då är stimulering området skannas av femtosecondlaser laser som konfokal mikroskopi. Således är provet endast stimuleras av femtosecondlaser laser när konfokala skanningsprocessen går in i en given bildruta.
Fotostimuleringssystemet kan fastställas på både inverterade och upprätt metallurgiska Mikroskop enligt försökspersonerna. In vitro-celler odlade i petriskålar är bättre att arbeta med inverterade Mikroskop. Djur, särskilt hjärnor av levande djur, är mer lämpade med upprätt Mikroskop. I denna studie tar vi det inverterade mikroskopet som ett exempel. Det bör noteras att omslaget till petriskål inte öppnas under hela experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visar en fotostimulering strategi genom att kombinera en femtosecondlaser laser med en laser scanning konfokala Mikroskop system. Photostimulation kan direkt fungera som en två-Photon mikroskopi genom att definiera Stim-B i enlighet därmed. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att utnyttja en kort blixt av femtosecondlaser laser för att utlösa ERK signalering eller mitoblixtar i målceller. De olika stimuleringslägen kan utföras enligt olika experimentella syften och system. Stim-A kan enkelt ställ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81571719 och 81661168014, 81673014 och 81870055), Shanghais kommunala vetenskaps-och teknik kommitté (18QA1402300 och 16XD1403100), och National Key R & D plan (2017YFA0104600).
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
Riferimenti
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
- Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
- Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson’s disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
- Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
- Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
- He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
- Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
- Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
- He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
- Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
- Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
- Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
- Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
- Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).
- Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
- Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).
