Contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome murin à partir de cellules souches de mélanocytes mutants
Summary
La procédure suivante décrit une méthode de contrôle spatial et temporel de l’initiation de tumeurs mélanocytaires dans la peau dorsale murin, à l’aide d’un modèle de souris génétiquement modifiée. Ce protocole décrit l’initiation des mélanomes cutanés macroscopiques et microscopiques.
Abstract
Le mélanome cutané est bien connu comme le cancer de la peau le plus agressif. Bien que les facteurs de risque et les modifications génétiques majeures continuent d’être documentés avec une profondeur croissante, le taux d’incidence du mélanome cutané a montré une augmentation rapide et continue au cours des dernières décennies. Afin de trouver des méthodes préventives efficaces, il est important de comprendre les premiers pas de l’initiation du mélanome dans la peau. Des données antérieures ont démontré que les cellules souches de mélanocytes folliculaires (MCSCs) dans les tissus cutanés adultes peuvent agir comme des cellules d’origine du mélanome lorsqu’elles expriment des mutations oncogéniques et des altérations génétiques. La tumorigenèse causée par les MCSC sujettes aux mélanomes peut être induite lorsque les MCSCs passent d’un état de repos à actif. Cette transition dans les MCSCs sujettes aux mélanomes peut être favorisée par la modulation de l’état d’activité des cellules souches du follicule pileux ou par des facteurs environnementaux extrinsiques tels que l’ultraviolet-B (UV-B). Ces facteurs peuvent être manipulés artificiellement en laboratoire par dépilation chimique, ce qui provoque la transition des cellules souches de follicule pileux et des MCSCs d’un état de repos à actif, et par l’exposition UV-B utilisant une lumière de paillehaut. Ces méthodes permettent un contrôle spatial et temporel réussi de l’initiation du mélanome cutané dans la peau dorsale murin. Par conséquent, ces systèmes de modèles in vivo seront utiles pour définir les premiers pas de l’initiation du mélanome cutané et pourraient être utilisés pour tester les méthodes potentielles de prévention des tumeurs.
Introduction
Le mélanome, la forme maligne des tumeurs mélanocytaires, est le cancer le plus agressif dans la peau avec un mélanome cutané responsable de la majorité des décès par cancer de la peau1. Aux États-Unis, le mélanome est couramment diagnostiqué; Il devrait s’agir du 5ème au 6ème type de cancer le plus fréquent parmi les nouveaux cas de cancer estimés en 20182. En outre, alors que les incidences globales sur le cancer ont montré la tendance de la réduction progressive au cours des dernières décennies, les taux d’incidence des mélanomes cutanés au cours des dernières décennies démontrent une augmentation continue et rapide des deux sexes2.
Pour lutter plus efficacement contre le mélanome cutané, il est important de bien comprendre les premiers événements du développement du mélanome à partir de leurs cellules d’origine afin de mieux identifier les méthodes préventives cliniquement efficaces. Il est maintenant connu que les cellules souches adultes peuvent contribuer significativement à la formation de tumeurs comme les origines cellulaires des cancers dans de nombreux types différents d’organes, y compris les tissus de la peau3,4,5. De même, les cellules souches de mélanocytes adultes (mcscs) dans la peau dorsale murin peuvent fonctionner comme des cellules de mélanome d’origine lors d’une activation aberrante des voies RAS/RAF et Akt 6. Cependant, ces mutations oncogéniques seules ne sont pas en mesure d’induire efficacement la formation de tumeurs des MCSC quiescents. les tumeurs mélanocytaires finissent par se développer lorsque les MCSCs deviennent actifs lors du cyclisme sur les cheveux naturels. Cependant, dans ce protocole, nous décrirons des méthodes pour induire artificiellement l’activation cellulaire des mcscs sujettes à la tumeur, facilitant ainsi un contrôle précis du mélanome initiation6,7.
Grâce aux méthodes décrites ici, le contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome cutané à partir de MCSCs à tendance tumorale exprimant des BRAFV600E oncogéniques ainsi que la perte d’expression de PTEN peuvent être exécutés avec succès, car nous ont déjà rapporté6. Cette méthode incorpore les résultats antérieurs qui démontrent l’activation de cellules souches de follicule pileux par dépilation ainsi que comment l’exposition de la peau de murin à UV-B peut faciliter l’activation des mcscs résidant au follicule pileux et à la translocation de ce cellulaire sous-population à l’épiderme interfolliculaire6,8,9,10. Ces systèmes de modèles in vivo peuvent fournir des informations précieuses sur la façon dont les changements physiologiques et environnementaux peuvent altérer l’État cellulaire des MCSC sujettes aux mélanomes, qui à leur tour peuvent induire une initiation significative du mélanome dans la peau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les altérations génétiques de marque fréquemment trouvées dans les tumeurs cutanées de mélanome ont été bien décrites13. La mutation de conducteur la plus dominante est BRAFV600E, et un modèle de souris génétiquement modifié pour le mélanome de BRAFV600Ea été généré par le groupe Bosenberg14 et déposé dans le laboratoire de Jackson. En utilisant ce modèle de souris, notre étude récente a démontré l’exigenc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par le Bureau du sous-secrétaire à la défense pour les affaires de santé, par l’entremise du programme de recherche sur le cancer par les pairs sous le prix W81XWH-16-1-0272. Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la défense. Ce travail a également été appuyé par une subvention de semences du programme de cellules souches de Cornell à A.C. White. H. Moon a été soutenue par le Cornell Center for Vertéate génomique Scholar Program.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Riferimenti
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