التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية
Summary
يصف الاجراء التالي طريقه للسيطرة المكانية والزمانيه لبدء ورم الخلايا الصباغية في الجلد الظهري المريد ، وذلك باستخدام نموذج الماوس المهندسة وراثيا. يصف هذا البروتوكول المجهرية بالاضافه إلى بدء الورم الميلاني الجلدي.
Abstract
الورم الميلاني الجلدي معروف جيدا بسرطان الجلد الأكثر عدوانيه. وعلي الرغم من استمرار توثيق عوامل الخطر والتغيرات الجينية الرئيسية بعمق متزايد ، فقد اظهر معدل الاصابه بسرطان الجلد الجلدي زيادة سريعة ومستمرة خلال العقود الاخيره. من أجل العثور علي أساليب وقائية فعاله ، من المهم ان نفهم الخطوات المبكرة من البدء في سرطان الجلد. أظهرت البيانات السابقة ان الخلايا الجذعية للخلايا الميلانينيه (MCSCs) في انسجه البشرة البالغة يمكن ان تكون خلايا المنشا الميلانوما عند التعبير عن الطفرات الجينية والتعديلات الوراثية. ويمكن ان يسببه الورم الناجم عن الأورام السرطانية المعرضة للاصابه بسرطان الجلد عند انتقال MCSCs من السكون إلى الحالة النشطة. ويمكن الترويج لهذا الانتقال في MCSCs المعرضة لسرطان الجلد من خلال تحوير اما الخلايا الجذعية بصيلات الشعر ‘ الدولة النشاط أو من خلال العوامل البيئية الخارجية مثل الاشعه فوق البنفسجية-B (الاشعه فوق البنفسجية-B). يمكن التلاعب بهذه العوامل بشكل مصطنع في المختبر عن طريق أزاله الشعر الكيميائي ، والذي يسبب انتقال الخلايا الجذعية بصيلات الشعرة و MCSCs من الهدوء إلى الحالة النشطة ، والتعرض للاشعه فوق البنفسجية-B باستخدام ضوء السطح. توفر هذه الطرق التحكم المكاني والزماني الناجح لبدء الجلد الميلاني الجلدي في البشرة الظهرية المرجينه. ولذلك ، فان هذه النظم في نموذج الجسم الفيفو تكون ذات قيمه لتحديد الخطوات المبكرة للبدء الجلدية الميلانوما ويمكن استخدامها لاختبار الطرق المحتملة للوقاية من الأورام.
Introduction
الميلانوما ، الشكل الخبيث للأورام الصباغية ، هو السرطان الأكثر عدوانيه في الجلد مع الميلانوما الجلدية المسؤولة عن معظم وفيات سرطان الجلد1. في الولايات المتحدة ، يتم تشخيص سرطان الجلد عاده ؛ ومن المتوقع ان يكون نوع السرطان الأكثر شيوعا من 5 إلى 6 من بين حالات السرطان الجديدة المقدرة في 20182. وعلاوة علي ذلك ، ففي حين أظهرت حالات السرطان العامة اتجاه الانخفاض التدريجي في العقود الاخيره ، فان معدلات الاصابهبالورم الميلانيني الجلدي خلال العقود القليلة الماضية تدل علي زيادة مستمرة وسريعة في كلا الجنسين.
لمكافحه الميلانوما الجلدية بشكل أكثر كفاءه ، من المهم ان نفهم بوضوح الاحداث المبكرة لنمو سرطان الجلد من خلايا المنشا الخاصة بهم للتعرف بشكل أفضل علي الطرق الوقائية الفعالة سريريا. ومن المعروف الآن ان الخلايا الجذعية الكبار يمكن ان تسهم بشكل كبير في تكوين الورم والأصول الخلوية للسرطان في العديد من أنواع مختلفه من الأعضاء بما في ذلك انسجه الجلد3,4,5. المثل ، يمكن للخلايا الجذعية البالغة الخلايا الصباغية (MCSCs) في الجلد الظهري المريد ان تعمل كخلايا من أصل الميلانوما عند التنشيط الشاذ للراس/Raf و akt مسارات6. ومع ذلك ، فان هذه الطفرات اونكوغينيك وحدها ليست قادره علي تحفيز تكوين الورم بكفاءة من MCSCs هادئه. أورام الخلايا الصباغية تتطور في نهاية المطاف عندما تصبح MCSCs نشطه اثناء ركوب الشعر الطبيعي. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، فاننا سوف تصف أساليب للحث بشكل مصطنع تنشيط الخلوية من mcscs المعرضة للورم ، التالي تسهيل التحكم الدقيق في بدء الورم الميلاني6،7.
من خلال الطرق الموصوفة هنا ، والسيطرة المكانية والزمانيه من سرطان الجلد الشروع الجلدية من MCSCs المعرضة للورم التعبير عن الV600E braf بالاضافه إلى فقدان التعابير pten يمكن ان يؤديها بنجاح ، ونحن سبق ان أبلغت عن6. هذا الأسلوب يدمج النتائج السابقة التي تثبت الخلايا الجذعية الشعرية التنشيط من خلال أزاله الشعر ، فضلا عن كيفيه التعرض للجلد murine إلى الاشعه فوق البنفسجية-B يمكن ان تسهل تفعيل MCSCs المقيمين في بصيلات الشعر ونقل هذه الخلوية السكان الفرعيين إلى البشرة البينية6،8،9،10. ويمكن لهذه النظم في نموذج الجسم الفيزيائي توفير معلومات قيمه فيما يتعلق بكيفية تغيير الفسيولوجية والبيئية يمكن ان تغير الوضع الخلوي لل MCSCs المعرضة للميلانوما ، والتي بدورها يمكن ان تحفز البدء الكبير من سرطان الجلد في البشرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التغييرات الوراثية المميزة التي كثيرا ما وجدت في أورام سرطان الجلد الجلدي وصفت جيدا13. طفرة السائق الأكثر هيمنة هو BrafV600E، وتم إنشاء نموذج الماوس المهندسة وراثيا لسرطان الجلد brafV600Eبوساطة مجموعه Bosenberg14 وأودعت في مختبر جاكسون. باستخدام هذا النم…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل مكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية ، من خلال برنامج أبحاث السرطان الذي استعرضه النظراء تحت الجائزة W81XWH-16-1-0272. الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي تلك التي لدي المؤلفين ولا تحظي بالضرورة بتاييد وزاره الدفاع. وكان هذا العمل مدعوما أيضا بمنحه البذور من برنامج الخلايا الجذعية كورنيل إلى الأبيض. وقد دعمت h. القمر من قبل مركز كورنيل لفقاري الجينوم الباحث عن البرنامج.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Riferimenti
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C. Tracing the cellular origin of cancer. Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M. SnapShot: melanoma. Cancer Cell. 23 (5), (2013).
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
