Controllo spaziale e temporale dell'iniziazione del melanoma murino dalle cellule staminali di melanociti mutanti
Summary
La seguente procedura descrive un metodo per il controllo spaziale e temporale dell’iniziazione tumorale melanocitica nella pelle dorsali murina, utilizzando un modello di topo geneticamente modificato. Questo protocollo descrive l’iniziazione macroscopica e microscopica del melanoma cutaneo.
Abstract
Il melanoma cutaneo è ben noto come il cancro della pelle più aggressivo. Sebbene i fattori di rischio e le principali alterazioni genetiche continuino a essere documentati con maggiore profondità, il tasso di incidenza del melanoma cutaneo ha mostrato un rapido e continuo aumento negli ultimi decenni. Al fine di trovare metodi preventivi efficaci, è importante comprendere i primi passi dell’iniziazione del melanoma nella pelle. I dati precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali follicolari dei melanociti (MCSC) nei tessuti cutanei adulti possono fungere da cellule di melanoma di origine quando esprimono mutazioni oncogeniche e alterazioni genetiche. La tumorigenesi derivante da MCSCs inclini al melanoma può essere indotta quando MCSCs passa da uno stato quiescente a uno attivo. Questa transizione in MCSCs inclini al melanoma può essere promossa dalla modulazione dello stato di attività delle cellule staminali follicoli piliferi o da fattori ambientali estrinseci come l’ultravioletto-B (UV-B). Questi fattori possono essere manipolati artificialmente in laboratorio mediante depilazione chimica, che provoca la transizione delle cellule staminali follicoli piliferi e delle MCSC da una condizione di quiescenza a quella attiva, e dall’esposizione UV-B utilizzando una luce da banco. Questi metodi forniscono un controllo spaziale e temporale riuscito dell’iniziazione cutanea del melanoma nella pelle dorsale murina. Pertanto, questi sistemi di modelli in vivo saranno preziosi per definire i primi passi dell’inizio del melanoma cutaneo e potrebbero essere usati per testare i potenziali metodi per la prevenzione del tumore.
Introduction
Il melanoma, la forma maligna dei tumori melanocitici, è il tumore più aggressivo della pelle con melanoma cutaneo responsabile della maggior parte dei decessi per cancro della pelle1. Negli Stati Uniti, il melanoma è comunemente diagnosticato; si prevede di essere il 5° al 6° tipo di cancro più comune tra i nuovi casi di cancro stimato in 20182. Inoltre, mentre le incidenze tumorali complessive hanno evidenziato l’andamento della progressiva riduzione degli ultimi decenni, i tassi di incidenza del melanoma cutaneo negli ultimi decenni dimostrano un aumento continuo e rapido di entrambi i sessi2.
Per combattere il melanoma cutaneo in modo più efficiente, è importante comprendere chiaramente i primi eventi di sviluppo del melanoma dalle loro cellule di origine per identificare meglio i metodi preventivi clinicamente efficaci. Ora è noto che le cellule staminali adulte possono contribuire significativamente alla formazione tumorale come origine cellulare dei tumori in molti tipi diversi di organi, compresi i tessuti cutanei3,4,5. Analogamente, le cellule staminali melanocitarie adulte (MCSC) nella pelle dorsale murina possono funzionare come cellule di melanoma di origine all’attivazione aberrante dei pathway RAS/RAF e Akt 6. Tuttavia, queste mutazioni oncogeniche da sole non sono in grado di indurre efficacemente la formazione tumorale da MCSCs quiescenti. i tumori melanocitici si sviluppano quando MCSCs diventano attivi durante il ciclismo naturale dei capelli. Tuttavia, in questo protocollo, descriveremo i metodi per indurre artificialmente l’attivazione cellulare di MCSCS inclini al tumore, facilitando così un controllo preciso dell’inizio del melanoma6,7.
Attraverso i metodi qui descritti, il controllo spaziale e temporale dell’iniziazione cutanea del melanoma da MCSCs inclini al tumore che esprimono BRAFV600E oncogenico insieme alla perdita dell’espressione PTEN può essere eseguito con successo, come abbiamo hanno riferito in precedenza6. Questo metodo incorpora precedenti risultati che dimostrano l’attivazione delle cellule staminali follicolari dei capelli attraverso la depilazione, così come l’esposizione della pelle di murina a UV-B può facilitare l’attivazione di MCSCs residente al follicolo pilifero e la traslocazione di questo cellulare sottopopolazione all’epidermide interfollicolare6,8,9,10. Questi sistemi di modelli in vivo possono fornire informazioni preziose su come i cambiamenti fisiologici e ambientali possono alterare lo stato cellulare dei MCSC inclini al melanoma, che a loro volta possono indurre una significativa iniziazione del melanoma nella pelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le alterazioni genetiche di Hallmark che si trovano frequentemente nei tumori del melanoma cutaneo sono state ben descritte13. La mutazione più dominante del conducente è BRAFV600E, e un modello di topo geneticamente modificato per il melanoma BRAFV600E-mediato è stato generato dal gruppo Bosenberg14 e depositato nel Jackson Laboratory. Utilizzando questo modello di topo, il nostro recente studio ha dimostrato il requisito dell’att…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’ufficio dell’assistente segretario della difesa per gli affari sanitari, attraverso il programma di ricerca sul cancro peer reviewed sotto il premio W81XWH-16-1-0272. Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dal dipartimento della difesa. Questo lavoro è stato sostenuto anche da una sovvenzione di seme dal programma di cellule staminali Cornell a A.C. White. H. Moon è stato supportato dal Cornell Center for vertebrate Genomics Scholar Program.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Riferimenti
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C. Tracing the cellular origin of cancer. Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M. SnapShot: melanoma. Cancer Cell. 23 (5), (2013).
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
